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基因重组腺病毒KH901的抗肿瘤研究

作　者: 沈富兵
导　师: 王莉
学　校: 四川大学
专　业: 药理学
关键词: KH901 选择性复制溶瘤 GM-CSF 重组腺病毒
分类号: R730.5
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

背景与目的：KH901是一种肿瘤特异、有条件复制的腺病毒，其ElA基因受基因工程改造的端粒酶反转录启动子的控制，可在端粒酶高活性的肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞，而在端粒酶活性低的正常细胞中不能复制。同时，在腺病毒基因组E3区安插有GM-CSF的cDNA而取代MHC抑制基因，在肿瘤部位表达具有刺激免疫反应的GM-CSF。GM-CSF被认为是激发特异、持久抗肿瘤免疫的最主要的细胞因子。这样，KH901不仅能通过溶解细胞效应直接杀死肿瘤细胞而产生局部的抗肿瘤效应，而且也激发系统性的抗肿瘤免疫对远端的肿瘤组织产生作用。我们将通过体内、体体外等一系列实验来验证KH901的选择性复制和溶瘤作用，并考察其体内、体外表达GM-CSF的水平和生物分布状况。实验方法：体外实验：将KH901感染平板培养的人肿瘤和正常细胞，分别在感染24h和72h后测定KH901表达GM-CSF的水平和病毒载体感染量，并以MTT法测定KH901对平板培养的人肿瘤和正常细胞的选择性杀伤作用。体内实验：裸鼠皮下接种Hep3B、LNcap和SCC9细胞，构建相应移植瘤裸鼠模型。KH901瘤体内注射给药，以“相对肿瘤增值率”和“抑瘤率”来观察抗肿瘤效果。C57小鼠皮下接种CMT-64细胞，构建CMT-64移植瘤裸鼠模型，观察KH901瘤体内给药后的抗肿瘤效果，并检测肿瘤引流淋巴结CD11c阳性细胞的百分率。A549移植瘤体内注射KH901，于不同的时间点采血并摘取肿瘤，以ELISA法测定血清和肿瘤匀浆液中rhGM-CSF含量，以定量PCR测定KH901在肿瘤及各脏器中的组织分布。结果：体外实验显示，KH901在肿瘤细胞中大量复制(2526.4±136.8～2796.6±104.6TCID₅₀/Cell)，表达大量的人GM-CSF[621.907±10.17～3924.497±17.79IU/（10⁶细胞/24h）]，并显示出明显的杀伤作用(IC₅₀为0.31±0.06～0.19±0.01MOI)，而在正常细胞中复制较差(56.8±9.2～90.1±14.4TCID₅₀/Cell)，只有少量的GM-CSF产生[13.397±0.82IU/（10⁶细胞/24h）]，杀伤作用轻微(IC₅₀为92.33±9.12～121.20±19.94 MOI)。体内实验显示，KH901对Hep3B、LNcap和SCC9裸鼠移植瘤皆有显著的抗瘤效果；对CMT-64移植瘤有一定的抗瘤作用，但未显示诱生鼠CDllc+细胞的能力；在A549移植瘤的肿瘤和血清中能检测到大量腺病毒载体和GM-CSF表达，并随时间推移而减低，其他脏器的生物分布较少。结论：KH901具有肿瘤选择性复制和杀伤作用，并能表达具有生物活性的GM-CSF，显示出对实体性肿瘤的较强溶瘤治疗作用。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
前言  8-10
1 材料  10-12
  1.1 实验药品  10
  1.2 实验用细胞株  10-11
  1.3 主要试剂  11
  1.4 主要仪器  11-12
  1.5 实验动物  12
2 方法  12-17
  2.1 KH901的体外抗肿瘤实验  12-13
    2.1.1 KH901对Rb(-)、TERT(-)的细胞的选择性复制和表达GM-CSF实验  12
    2.1.2 KH901对Rb(-)、TERT(+)肿瘤细胞的选择性复制和表达GM-CSF实验  12-13
    2.1.3 KH901体外肿瘤细胞杀伤实验(MTT法)  13
  2.2 KH901的体内抗肿瘤实验  13-15
    2.2.1 KH901在Hep3B裸鼠移植瘤模型中的抗肿瘤实验  13-14
    2.2.2 KH901在LNcap裸鼠移植瘤模型中的抗肿瘤实验  14-15
    2.2.3 KH901在裸鼠头颈癌细胞SCC9肿瘤模型中抗肿瘤实验  15
    2.2.4 KH901在C57BL/6小鼠的CMT-64肿瘤模型中抗肿瘤实验  15
  2.3 KH901在小鼠肿瘤模型中表达GM-CSF及其效应的实验  15-16
    2.3.1 KH901在A549裸鼠移植瘤模型中表达GM-CSF的实验  15-16
    2.3.2 KH901在CMT-64肿瘤模型中诱生CDllc+细胞的实验  16
  2.4 KH901的生物分布实验  16-17
    2.4.1 KH90在裸鼠A549肿瘤模型中的生物分布及病理学分析实验  16-17
    2.4.2 KH901在恒河猴动物体内的生物分布实验  17
3 结果  17-29
  3.1 KH901的体外抗肿瘤作用  17-20
    3.1.1 KH901对Rb(-)、TERT(-)的细胞的选择性复制及表达GM-CSF  17-18
    3.1.2 KH901对Rb(-)、TERT(+)的肿瘤细胞的选择性复制及表达GM-CSF  18-20
    3.1.3 KH901体外肿瘤细胞的杀伤作用  20
  3.2 体内实验结果  20-24
    3.2.1 KH901在Hep3B裸鼠移植瘤模型中的抗肿瘤效果  20-21
    3.2.2 KH901在LNcap裸鼠移植瘤模型中的抗肿瘤效果  21-23
    3.2.3 KH901在SCC9裸鼠移植瘤模型中的抗肿瘤效果  23
    3.2.4 KH901与KH920对CMT-64肿瘤模型的抑瘤效果  23-24
  3.3 KH901在小鼠肿瘤模型中表达GM-CSF及其效应  24-27
    3.3.1 KH901在A549裸鼠移植瘤模型中GM-CSF的表达  24-26
    3.3.2 KH901与KH920在CMT-64肿瘤模型中诱生CDIIc+细胞的效果  26-27
  3.4 KH901的生物分布状况  27-29
    3.4.1 KH90在裸鼠A549肿瘤模型中的生物分布  27-28
    3.4.2 KH901在恒河猴动物体内的生物分布  28-29
4 讨论  29-35
5 结论  35-36
主要参考文献  36-39
附件1:特异性溶瘤重组腺病毒的研究现状及其临床前药理学评价策略(综述)  39-63
  前言  40-41
  1 特异溶瘤腺病毒的构建  41-42
  2 特异溶瘤腺病毒的种类  42-45
    2.1 第一类特异溶瘤腺病毒  42-44
      2.1.1 Onyx-015  43-44
      2.1.2 Ad5-D24  44
    2.2 第二类特异溶瘤腺病毒  44-45
    2.3 第三类特异溶瘤腺病毒  45
  3 特异溶瘤腺病毒与其他疗法的联合应用  45-48
    3.1 特异溶瘤腺病毒联合化疗  45-46
    3.2 特异溶瘤腺病毒联合放疗  46-47
    3.3 特异溶瘤腺病毒联合基因治疗  47-48
  4 生物治疗合并GM-CSF的抗肿瘤作用  48-52
    4.1 GM-CSF作为肿瘤疫苗的组成部分  48-49
    4.2 GM-CSF作为细胞疫苗组成部分  49-50
    4.3 GM-CSF作为基因疫苗组成部分  50
    4.4 免疫分子与GM-CSF联合使用  50-51
    4.5 抗癌基因与GM-CSF联合使用  51-52
  5 特异性溶瘤重组腺病毒的临床前药理学评价  52-55
    5.1 效力评价  52-54
      5.1.1 川体外实验  52
      5.1.2 体内实验  52-54
    5.2 药代动力学  54-55
  结语  55-57
  参考文献  57-63
附件2:KH901生物分布实验病理图片  63-67
附件3 实验数据及实验方法列举  67-76
  附3.1 各细胞MTT法测定IC_(50)的数据  67-68
  附3.2 腺病毒滴度测定法(TCID_(50)法)  68-69
  附3.3 人GM_CSF ELlSA法检测  69-70
  附3.4 人GM-CSF生物活性测定  70-71
  附3.5 荧光定量PCR操作步骤及结果  71-76
其他作者和指导老师简介  76-77
致谢  77-78

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