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低温胁迫对香蕉幼苗生理特性的影响及冷诱导相关基因的分离

作　者: 刘德兵
导　师: 彭明
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 农业生物技术
关键词: 香蕉生理指标叶片形态解剖结构 ADGE 冷诱导 rbcS
分类号: S668.1
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

香蕉是世界四大粮食之一,具有很高的经济价值,是热带农业的支柱产业。我国华南产区常因寒潮入侵而导致大面积的蕉园受到毁灭性伤害,经济损失极大。培育抗寒品种一直是香蕉育种的主要育种目标之一,但是目前新选（培）育的抗寒品种,并没有从根本上解决香蕉的抗寒问题,因此,迫切要求加强香蕉抗寒机理研究,为培育抗寒香蕉新品种、降低生产上寒害损失、扩大种植面积,提供理论依据。本研究以我国目前香蕉的主栽品种巴西蕉为试验材料,通过采用不同浓度的脱落酸（ABA）和油菜素内酯（BR）对香蕉幼苗进行预处理,然后进行程序降温到7℃并维持在7℃12个小时,然后测定电导率、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、MDA含量、SOD活性及叶绿素含量,进行香蕉幼苗植株形态、功能叶形态及叶片细胞组织结构解剖研究。对处理与对照之间的差异片段进行克隆,针对获得的克隆片段进行NCBI核酸蛋白数据库比较分析,获得与抗寒相关的克隆,运用3’-RACE和5’-RACE技术,扩增出香蕉rbcS-mc的基因全长,并对所获得的基因进行生物信息学、RT-PCR及转基因分析,获得的主要结论如下:1、冷胁迫条件下的香蕉幼苗经浓度分别为5mg·L^-1、10mg·L^-1、15mg·L^-1、20mg·L^-1及25mg·L^-1的ABA及0.3mg·L^-1、0.6mg·L^-1、0.9mg·L^-1、1.2mg·L^-1及1.5mg·L^-1的BR处理后,相对于对照来说,在一定的处理浓度范围内,可以明显的降低电解质外渗率,提高低温胁迫下香蕉幼苗叶片中SOD的活性,一定程度上提高了低温胁迫下香蕉幼苗叶片中可溶性蛋白的含量,减缓叶片中MDA的含量变化,可溶性糖含量明显的提高,同时,明显的减缓了叶片中叶绿素降解的速度。这些代谢产物的变化,对提高香蕉幼苗冷胁迫期间的抵抗能力起着非常关键和重要的作用。保护效果最好的浓度分别是:ABA为20mg·L^-1、BR为0.9mg·L^-1。2、7℃下培养12h后植株外部形态的变化存在明显差异,结果表明经20 mg·L^-1（处理A4）的ABA处理后,所试植物植株生长良好,叶色浓绿有光泽,植株健壮,冷害0级,冷害指数为4.5%,效果最好,而对照CK1经过此温度处理后有75 %的叶片完全萎蔫,其余叶片均有轻微冻伤,冷害3级,出现1株死亡,冷害指数为76%,差异显著。对于BR的不同处理来说,经0.9mg·L^-1的BR处理后,所试植株外观与处理A4接近,冷害0级,冷害指数为4.1%。说明施用一定浓度的BR或ABA后,可在一定程度上提高香蕉幼苗的抗寒性,但提高效果并非与ABA或BR的施用浓度呈正比。在解剖结构方面,随着冷胁迫的继续,香蕉叶片细胞组织结构紧密度呈现了较为有规律的变化,叶片厚度变薄,BR处理相对于对照来说,叶片的角质层、栅栏组织等保护组织在冷胁迫一定程度以后呈现增厚的趋势,CTR值也由CK的51.1%降低为BR处理的47.5%。3、运用ADGE技术,克隆到在BR诱导下的低温胁迫香蕉幼苗中特异表达的18个cDNA片段并测序,在三大国际核酸数据库中进行同源性搜索,其中克隆2-1T与核酸数据库中编号为AF008214的尖叶蕉1, 5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（RuBP）羧化酶小亚基rbcS1克隆在466bp内的一致性达到99%。分别利用TaKaRa的3’- RACE及5’- RACE试剂盒,获得香蕉1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基（rbcS-mc）基因的3’和5’端序列。将3’和5’序列以及已知的克隆片断序列用DNAstar软件进行拼接得到了预计长度的一个含完全编码区的香蕉的1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基（rbcS-mc）基因序列,并进行一些生物信息学分析及对香蕉rbcS-mc基因在香蕉植株不同部位的表达情况进行了RT-PCR分析验证。RT-PCR分析结果显示该基因在香蕉植株的叶片中的表达量比叶鞘中的高,根中不表达,表明香蕉rbcS-mc基因在香蕉植株中具有组织特异性表达。4、根据已获得的香蕉rbcS-mc基因完整ORF序列设计引物,利用香蕉rbcS-mc基因的cDNA为模板,克隆得到香蕉rbcS-mc基因ORF全长,并构建了含有完整编码区植物表达载体,转化农杆菌GV3101,通过叶盘法转化烟草植株,为进一步研究香蕉rbcS-mc基因的性质功能奠定了基础。

全文目录

中文摘要  8-10
英文摘要  10-13
第一部分文献综述  13-40
  第一章植物抗寒、基因克隆及香蕉抗寒研究进展  13-40
    1.1 植物的抗寒性  13-15
      1.1.1 冷冻伤害及低温驯化植物的生理生化变化  13-14
      1.1.2 植物的低温胁迫响应  14-15
    1.2 植物的抗冻基因及其表达产物功能  15-16
    1.3 抗冻基因的表达调控  16-19
      1.3.1 低温信号的转导  17-18
      1.3.2 CBF/DREB1 转录活化因子调节抗冻基因的表达  18-19
    1.4 诱导抗冻基因充分表达的条件  19-22
      1.4.1 温度条件  19-20
      1.4.2 光照条件  20
      1.4.3 水分条件  20-21
      1.4.4 植物激素  21-22
    1.5 差异表达基因分离技术及其应用  22-29
      1.5.1 mRNA 差异显示  23-24
      1.5.2 cDNA 代表性差异分析  24
      1.5.3 抑制性消减杂交  24-26
      1.5.4 DNA 芯片  26
      1.5.5 cDNA-AFLP  26-27
      1.5.6 ADGE  27-29
    1.6 香蕉抗寒研究进展  29-37
      1.6.1 香蕉抗寒力评价指标  30-32
      1.6.2 香蕉寒害产生的机理  32-34
      1.6.3 香蕉抗寒相关基因的克隆与表达  34-35
      1.6.4 抗寒防寒栽培技术  35
      1.6.5 问题与展望  35-37
    1.7 研究意义  37-38
    1.8 研究内容与范围  38-39
      1.8.1 脱落酸及油菜素内酯对香蕉幼苗抗寒性的影响  38
      1.8.2 ABA 和BR 对香蕉幼苗形态学细胞组织学的影响  38
      1.8.3 ADGE 技术研究香蕉幼苗冷胁迫的分子机理  38-39
      1.8.4 香蕉 1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因(rbcS-mc) 的克隆,生物信息学分析及表达  39
      1.8.5 香蕉 1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因(rbcS-mc) 的植物表达载体的构建及烟草的转化  39
    1.9 本研究技术路线  39-40
第二部分正文部分  40-115
  第二章脱落酸（ABA）及油菜素内酯（BR）对香蕉幼苗抗寒性的影响  40-51
    2.1 材料与方法  40-43
      2.1.1 材料  40
      2.1.2 处理方法  40
      2.1.3 生理指标测定  40-43
    2.2 结果与分析  43-49
      2.2.1 脱落酸(ABA)对香蕉幼苗抗寒性的影响  43-46
      2.2.2 油菜素内酯（BR）对香蕉幼苗抗寒性的影响  46-49
    2.3 结论  49-50
    2.4 讨论  50-51
  第三章 ABA 和 BR 对香蕉幼苗形态学及细胞组织学的影响  51-60
    3.1 外部形态学观察及冷害分级  51-52
    3.2 组织切片  52-55
      3.2.1 材料  52
      3.2.2 方法  52-55
    3.3 结果与分析  55-58
      3.3.1 脱落酸（ABA）对低温胁迫下香蕉幼苗植株形态变化的影响  55
      3.3.2 脱落酸（ABA）对低温胁迫下香蕉幼苗功能叶形态变化的影响  55-56
      3.3.3 油菜素内酯（BR）对低温胁迫下香蕉幼苗外部形态变化的影响  56-57
      3.3.4 油菜素内酯（BR）对低温胁迫下香蕉幼苗功能叶形态变化的影响  57
      3.3.5 香蕉叶片组织与细胞结构  57
      3.3.6 油菜素内酯（BR）对低温胁迫下香蕉幼苗叶片解剖结构的影响  57-58
      3.3.7 油菜素内酯（BR）对低温胁迫下香蕉幼苗叶片组织细胞结构的影响  58
    3.4 讨论  58-60
  第四章 ADGE 技术研究香蕉幼苗冷胁迫的分子机理  60-79
    4.1 材料和试剂  60-63
      4.1.1 材料  60
      4.1.2 试剂  60
      4.1.3 溶液配制  60-62
      4.1.4 主要仪器  62-63
    4.2 实验方法  63-70
      4.2.1 ADGE 引物设计  63
      4.2.2 接头设计和合成  63
      4.2.3 植物总RNA 的提取与纯化  63-64
      4.2.4 mRNA 的纯化  64-65
      4.2.5 ADGE 分析  65-68
      4.2.6 PCR 产物的回收  68
      4.2.7 E.coli DH5α感受态细胞的制备  68-69
      4.2.8 待克隆片段与T-载体的连接及转化E. coli DH5α感受态细胞  69
      4.2.9 重组克隆的鉴定  69-70
      4.2.10 DNA 测序及同源序列的检索与比较  70
    4.3 实验结果  70-77
      4.3.1 总RNA 的提取  70-71
      4.3.2 m RNA 的提纯  71
      4.3.3 TaqI 酶消化  71-72
      4.3.4 PCR 扩增  72-73
      4.3.5 部分阳性克隆的酶切鉴定  73
      4.3.6 差异片断的序列分析  73-77
    4.4 讨论  77-79
  第五章香蕉1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因(rbcS-mc)的克隆,生物信息学分析及表达  79-106
    5.1 材料和试剂  79-80
      5.1.1 材料  79
      5.1.2 试剂  79-80
      5.1.3 主要仪器  80
    5.2 实验方法  80-87
      5.2.1 香蕉植株总RNA 的提取  80
      5.2.2 香蕉1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因（rbcS-mc）的5'端扩增  80-83
      5.2.3 香蕉1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因（rbcS-mc）的3'端扩增  83-84
      5.2.4 香蕉1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基（rbcS-mc）全长cDNA 的克隆  84-85
      5.2.5 香蕉1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基（rbcS-mc）的生物信息学分析  85-86
      5.2.6 香蕉1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基（rbcS-mc）的RT-PCR 表达分析  86-87
    5.3 结果与分析  87-104
      5.3.1 香蕉1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基（rbcS-mc）的cDNA 序列  87-90
      5.3.2 香蕉基因 rbcS-mc 核苷酸序列分析  90-93
      5.3.3 香蕉 rbcS-mc 蛋白的氨基酸序列分析  93-95
      5.3.4 香蕉rbcS-mc 基因编码蛋白的结构分析  95-100
      5.3.5 香蕉rbcS-mc 蛋白的二级结构预测  100
      5.3.6 香蕉rbcS-mc 蛋白的高级结构预测  100-101
      5.3.7 rbcS-mc与其它植物rbcS家族的蛋白质序列系统进化树分析  101-103
      5.3.8 香蕉rbcS-mc 基因在香蕉不同组织部位的RT-PCR 表达  103-104
    5.4 讨论  104-106
  第六章香蕉 1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因(rbcS-mc)的植物表达载体的构建及烟草的转化  106-115
    6.1 材料与试剂  106-107
      6.1.1 植物材料  106
      6.1.2 菌种与质粒  106
      6.1.3 主要试剂  106
      6.1.4 主要仪器  106-107
      6.1.5 常用缓冲液和试剂的成分及配制  107
    6.2 实验方法  107-111
      6.2.1 香蕉rbcS-mc 基因完整ORF 框的引物设计  107-108
      6.2.2 香蕉rbcS-mc 基因完整 ORF 框的 PCR 扩增  108
      6.2.3 植物表达载体的构建  108
      6.2.4 其它克隆操作  108-109
      6.2.5 植物转化  109-111
      6.2.6 转基因植株的PCR 检测  111
    6.3 实验结果  111-114
      6.3.1 植物表达载体pBrbcS 的构建  111-112
      6.3.2 重组农杆菌工程菌株的获得及鉴定  112
      6.3.3 转基因烟草的再生  112-113
      6.3.4 转基因烟草植株的PCR 检测  113-114
    6.4 讨论  114-115
结论  115-117
参考文献  117-127
附录1  127-132
附录2  132-134
致谢  134

低温胁迫对香蕉幼苗生理特性的影响及冷诱导相关基因的分离

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