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甘蔗亲本种特异DNA序列的PCR检测及原位PCR定位的研究

作　者: 王英
导　师: 郑成木；庄南生
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 甘蔗亲本种特异DNA序列传递动态原位PCR 染色体定位核型分析
分类号: S566.1
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

现代甘蔗栽培品种是一个遗传背景复杂的多倍体,其基因组的主体成份为热带种血缘,同时,又导入不少近缘种血缘,如割手密种、印度种、大茎野生种、中国种和斑茅等。本项目采用RAPD、ISSR标记等方法筛选、克隆了一系列甘蔗亲本种特异DNA片段,并进一步转化为甘蔗种、属特异PCR标记;并结合SSR标记特点,通过设计、合成与筛选SSR引物,找出可特异扩增甘蔗亲本种、属特异DNA序列的PCR引物;进而进行亲本种特异DNA序列在甘蔗亲本种及其后代栽培种中的遗传动态分析;同时对部分甘蔗亲本种、属特异DNA序列进行了原位PCR定位研究;并进行了甘蔗种质遗传基础的ISSR分析。本研究建立了快速、准确鉴定这些特定亲本遗传成分在甘蔗基因组中的结构特征的技术体系,为甘蔗遗传分析、种质鉴定及杂交亲本选配提供新的分子细胞学试验依据与方法。1筛选到113条甘蔗亲本种特异DNA片段,其中割手密种特异的53条,热带种特异19条,野生种特异10条,亲本种多态性条带31条。加上前期工作中从AFLP标记中回收但尚未纯化的46条甘蔗亲本特异片段,共得159条特异DNA片段。对其中72条特异DNA片段进行测序,得到了68条片段的序列组成。2设计合成了122对甘蔗亲本种特异引物,以12份甘蔗亲本种基因组为模板,对引物的特异性进行筛选,筛选到4类特异PCR引物。其中割手密种特异引物29对,甘蔗属内野生种特异引物14对,斑茅种质特异引物2对,甘蔗属特异引物27对。3利用部分特异PCR引物对39份亲本种和57份甘蔗栽培品种(品系)进行了特异PCR检测,分析了甘蔗亲本种特异血缘在后代中的传递情况及变化动态。结果表明,本试验筛选出的各种类型的特异DNA序列,均能以不同的概率在栽培种后代中传递,10条割手密特异DNA序列在含有割手密血缘的后代中传递时,ZT51-439序列传递率最高,为95.92%,ZT61-678传递率最低,为2%;25条野生种特异DNA序列在含有野生种血缘的甘蔗栽培种质中传递时,ZT85-700序列传递率最高,为92.98%,ZT82-460传递率最低,为17.54%。这表明甘蔗不同栽培种所含的野生种血缘是不同的。另外,18条甘蔗属特异DNA序列均能100%在后代中传递。16条斑茅种特异DNA序列能在含斑茅血缘的F1及F2代中传递而且传递率均为50%。4利用原位PCR技术,首次对甘蔗属特异DNA序列ZT37-377、ZT40-928和割手密种特异序列ZT52-439进行了染色体定位。这些特异DNA序列大多位于甘蔗拔地拉、崖城割手密11号的多条染色体的端粒,有少数位于染色体的着丝粒区域,个别位于染色体的整条臂上,属重复序列。其中ZT37-377初步定位于崖城割手密11号的第1~12号、第14~32号共56条染色体上;ZT40-928初步定位于拔地拉的第1~11号、第13~19号、第22~32号、第34~39号共69条染色体上;ZT52-439初步定位于崖城割手密11号的第2、5~7、9~20、23、25和29号共29条染色体上。5对崖城割手密11号和拔地拉进行了核型分析。崖城割手密11号的染色体核型公式为2n=64=56m(2sat)+8sm,绝对长度为1.54～2.95μm,相对长度为2.23%～4.28%,19号、28号、30及32号染色体为亚中部着丝点染色体(sm),其余28对染色体为中部着丝点染色体(m),第31号染色体短臂具有随体,核型为2A。拔地拉的染色体核型公式为2n=80=80m,绝对长度1.10～3.29μm,相对长度为1.39%～4.16%,40对染色体为中部着丝点染色体(m),核型为1B型。6对甘蔗属多态性引物ZT67扩增产物的热带种特异序列Aso64(378bp)、割手密特异序列Asp68(545bp)及Asp70(300bp)等序列进行同源比对,初步认为该热带种特异序列与割手密特异序列(Asp68、Asp70)之间的差异主要由于序列内部部分片段的缺失或插入而造成。此外,对21条有代表性的特异DNA序列进行了可能的功能基因分析。其中2条序列与已发表的功能序列有较低的同源性,而且所代表的可能功能大多与高梁二色克隆系列有关;而其余19条序列与已发表的功能序列几乎无同源性。7构建了96份甘蔗种质的ISSR指纹图谱,并进行了聚类分析;斑茅的指纹与甘蔗属存在着较明显的区别。云南割手密与崖城割手密、印度割手密及华南割手密未能聚在同一支,表明了割手密野生种种内变异水平高。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
1 前言  10-35
  1.1 甘蔗种质概述  10-11
  1.2 植物特异DNA 序列研究进展  11-21
    1.2.1 植物特异DNA 序列的类型  11-13
    1.2.2 植物特异DNA 序列筛选方法  13-15
    1.2.3 植物特异DNA序列的应用方法  15-16
    1.2.4 植物特异DNA 序列的应用研究进展  16-21
  1.3 植物原位PCR 的研究进展  21-27
    1.3.1 原位PCR 的基本原理  22-23
    1.3.2 植物原位PCR 技术的主要操作步骤  23-26
    1.3.3 植物原位PCR 应用进展  26-27
  1.4 甘蔗属的细胞遗传学及分子细胞遗传学研究进展  27-33
    1.4.1 甘蔗属的核型分析  28-29
    1.4.2 染色体传递行为  29-30
    1.4.3 甘蔗基因组原位杂交研究进展  30-31
    1.4.4 甘蔗种、属特异DNA 序列的研究进展  31-33
    1.4.5 甘蔗原位PCR 的研究进展  33
  1.5 本研究的目的意义和技术路线  33-35
    1.5.1 研究目的及意义  33-34
    1.5.2 研究的技术路线  34-35
2 材料与方法  35-49
  2.1 试验材料与试剂  35-37
    2.1.1 供试材料  35-36
    2.1.2 主要的仪器  36
    2.1.3 试剂  36-37
  2.2 试验方法  37-49
    2.2.1 甘蔗DNA提取  37-38
    2.2.2 甘蔗基因组DNA四种标记的PCR检测体系  38-40
    2.2.3 特异PCR标记的程序  40-43
    2.2.4 甘蔗亲本种特异DNA序列的原位PCR检测  43-47
    2.2.5 甘蔗种质遗传基础的ISSR 标记的数据分析  47-49
3 结果与分析  49-84
  3.1 甘蔗亲本种特异DNA 序列的PCR 检测  49-70
    3.1.1 甘蔗亲本种特异DNA 片段的筛选  49-52
    3.1.2 甘蔗亲本种特异DNA 片段的克隆与测序  52-53
    3.1.3 甘蔗亲本种特异引物设计与筛选  53-56
    3.1.4 甘蔗亲本种特异DNA 序列的PCR 检测  56-65
    3.1.5 甘蔗亲本种特异DNA 序列在甘蔗亲本种及其后代中的分布  65-67
    3.1.6 甘蔗亲本种特异DNA 序列可能的功能分析  67-70
  3.2 甘蔗亲本种特异DNA 序列的染色体原位PCR 定位检测  70-80
    3.2.1 崖城割手密11 号与拔地拉核型分析的结果  70-77
    3.2.2 甘蔗亲本种特异DNA 序列的染色体原位PCR 定位  77-80
  3.3 甘蔗种质遗传基础的ISSR 分析  80-84
    3.3.1 ISSR 指纹图谱的构建  80-81
    3.3.2 甘蔗种质间遗传相似性分析  81-84
4 讨论  84-90
  4.1 关于甘蔗亲本种特异DNA 序列在后代传递率高低的问题  84
  4.2 关于甘蔗亲本种特异 DNA 序列对甘蔗与斑茅远缘杂交后代杂种真实性的鉴定问题  84-85
  4.3 关于同一多态性引物扩增产物的 DNA 序列构成  85
  4.4 关于 PCR 引物设计的问题  85-87
  4.5 关于原位 PCR 的染色体标本制备及其保存  87-88
  4.6 关于特异 DNA 序列在原位 PCR 定位时信号强弱的问题  88-89
  4.7 关于不同特异 DNA 序列存在相同位置的问题  89-90
5 结论  90-92
参考文献  92-101
附表  101-127
附录  127-139
图版  139-153
缩略语  153-154
致谢  154

甘蔗亲本种特异DNA序列的PCR检测及原位PCR定位的研究

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