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外源基因整合及其对棉花受体亲本的影响

作　者: 张永山
导　师: 喻树迅
学　校: 华中农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 转基因棉花整合位点侧翼序列遗传效应 mAD模型基因差异表达表型变异
分类号: S562
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

棉花是重要的经济作物，转基因棉花在棉花生产中发挥着越来越大的作用。花粉管通道法是棉花遗传转化的主要方法之一。到目前为止，我国的转基因棉花品种中有40％以上是直接或间接通过花粉管通道法获得的。花粉管通道法遗传转化机理，转化的外源基因在受体亲本中的分布以及外源基因对受体的影响等方面的系统研究较少。本研究以源于同一受体亲本的30个的棉花转基因系为材料，分析转基因系表型变异的特点及规律，采用PCR Walking技术对外源基因整合的侧翼序列进行克隆，初步研究其整合特点；应用DDRT—PCR方法分析了转基因系与受体亲本之间的基因表达差异，探讨表型变异的分子机理；同时应用mAD模型对转基因系中外源基因整合的遗传效应进行了预测，从遗传效应上对外源基因对受体亲本的影响进行了评估。本研究的主要结论如下：1．建立了以PCR walking技术为基础的，在花粉管通道法转化的转基因系中克隆FST序列的技术体系。对12个转基因系的FST序列进行了克隆，共获得9个序列片段，其中5个全为载体序列，四个序列中包含未知序列，侧翼序列的有效获得率为33.3％。2．对获得序列通过DNAman软件进行比对分析，外源基因整合时可以携带更多载体序列一起整合到棉花基因组中，而不局限于边界序列，边界序列并不是整合所必需的。外源基因表达盒中的部分序列(35S启动子序列，GUS序列)以及质粒载体部分序列(如OriV)出现在侧翼序列中。应用Blast在internet上对未知序列进行查询分析，认为4个有效序列中，三个位于棉花基因区，一个位于棉花的重复序列或冗余序列等基因间区。3．通过花粉管通道法转入外源基因会引起受体亲本的较大的表型变异。转基因系的表型变化和外源基因的类型没有相关性。各转基因系整体上对纤维品质性状影响小，对产量及产量构成因素的影响较大。大部分转基因系(90％)在对铃重的影响上具有相似的变化规律，会显著或极显著地降低铃重。46.7％的转化系衣分没有显著变异，20％会显著或极显著地增加，33.3％会显著或极显著的降低。4．两个转基因系在纯合状态下总的基因表达差异率高于其受体亲本，说明外源基因的整合效应可促使受体亲本更多基因表达差异表达。但并不是在不同发育时期内都高于其受体亲本，在初花期(7月1日)和盛花期(7月15日)，两转基因系的基因表达差异率明显高于受体亲本，而蕾期(6月15日)和花铃期(8月1日)，却低于受体亲本。在杂合状态下，获得的平均重复序列条带数高于纯合状态下条带数，同时基因表达差异条带数也较大，但是其基因表达差异率却小于纯合状态。不同的转基因系在杂合状态下的基因表达差异率变化规律相似，均小于纯合状态下的差异率。5．应用mAD模型对转基因系439030的dQTL效应进行分解研究。结果表明439030的dQTL可显著地增加衣分和铃数，降低铃重，具有显著的加性效应，说明在转基因系439030中，外源基因整合效应所影响的QTL位点具有增加衣分(1.00±0.36*)和铃数(9.71±1.60*)，降低铃重(-0.57±0.06**)的遗传效应，而对籽棉产量、皮棉产量的影响更多的是这些位点于环境的互作效应。同时还对该dQTL的纯合、杂合显性效应以及遗传背景的效应进行了预测。以上研究结果为花粉管通道法的理解、改良，花粉管通道法转基因材料利用等提供了理论基础。利用DDRT—PCR研究转基因系与受体亲本之间基因表达差异为首次报道，将mAD模型用于转基因系中外源基因整合的遗传效应分解，是对转基因材料中QTL位点效应分析的一种新尝试。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
缩略词表  12-13
第一章文献综述  13-44
  1.1 转基因作物应用状况  13-16
  1.2 转基因棉花研究应用状况  16-17
    1.2.1 转基因抗虫棉的研究概况  16-17
    1.2.2 转基因抗虫棉应用现状  17
  1.3 外源基因的遗传转化方法  17-22
    1.3.1 农杆菌介导法  18-19
    1.3.2 基因枪法  19-20
    1.3.3 种质系统介导法  20-22
      1.3.3.1 花粉介导法  20
      1.3.3.2 花粉管通道法  20-22
  1.4 外源基因的整合  22-35
    1.4.1 外源基因进入受体细胞的过程  23-25
      1.4.1.1 农杆菌介导法中外源基因进入受体细胞的过程  23-24
      1.4.1.2 直接转化法中外源基因进入受体细胞的过程  24-25
    1.4.2 外源基因在受体基因组中的整合机理  25-29
    1.4.3 外源基因在受体基因组中的分布  29-35
      1.4.3.1 外源基因整合的随机论  29-30
      1.4.3.2 外源基因整合的优先论  30-35
  1.5 旁侧序列的克隆方法  35-39
    1.5.1 IPCR  35-36
    1.5.2 TAIL-PCR  36-37
    1.5.3 质粒营救法  37-38
    1.5.4 PCR步行法  38-39
  1.6 基因差异表达研究  39-43
    1.6.1 mRNA差异显示  39-40
    1.6.2 代表性差异分析  40-41
    1.6.3 抑制性扣除杂交  41-42
    1.6.4 基因表达系列分析  42
    1.6.5 DNA微阵列和基因芯片  42-43
  1.7 本研究的目的意义  43-44
第二章外源基因整合位点初步分析  44-75
  2.1 材料与方法  44-53
    2.1.1 试验材料  44
    2.1.2 基因来源  44-46
    2.1.3 相关试剂  46-47
      2.1.3.1 外源基因整合验证引物  46
      2.1.3.2 PCR walking引物  46
      2.1.3.3 接头及引物  46
      2.1.3.4 限制性内切酶  46-47
    2.1.4 方法  47-53
      2.1.4.1 花粉管通道转化植株的筛选与鉴定  47
      2.1.4.2 抗虫转化植株的复鉴  47-48
      2.1.4.3 棉花DNA提取  48-49
      2.1.4.4 DNA的质量检测及纯化  49-50
      2.1.4.5 酶切消化基因组DNA  50
      2.1.4.6 基因组DNA加接头  50-51
      2.1.4.7 PCR步行过程  51
      2.1.4.8 扩增序列的测序  51-53
      2.1.4.9 序列分析  53
  2.2 结果与分析  53-73
    2.2.1 花粉管通道法转基因系的鉴定与筛选  53-56
    2.2.2 不同转基因系的分子检测  56
    2.2.3 外源基因侧冀序列的克隆  56-58
    2.2.4 扩增序列分析  58-70
      2.2.4.1 SEQ13序列组成分析  59-61
      2.2.4.2 SEQ9序列结构分析  61-64
      2.2.4.3 SEQ2序列结构分析  64-66
      2.2.4.4 SEQ4的序列结构分析  66-70
    2.2.5 扩增序列比较  70-71
    2.2.6 整合携带载体序列比较  71-73
    2.2.7 侧翼序列碱基含量比较  73
  2.3 讨论  73-75
第三章外源基因整合对受体亲本产量品质性状的影响  75-84
  3.1 试验材料与方法  75-76
    3.1.1 试验材料  75-76
      3.1.1.1 试验设计  75
      3.1.1.2 数据调查  75-76
    3.1.2 数据分析  76
  3.2 结果与分析  76-82
    3.2.1 转基因系主要性状的变异  76
    3.2.2 主要性状间高级净相关分析  76-81
    3.2.3 转基因系表型聚类分析  81-82
  3.3 讨论  82-84
第四章外源基因整合对基因表达差异的影响  84-107
  4.1 材料与方法  84-90
    4.1.1 试验材料  84-85
    4.1.2 引物选择和筛选  85-86
    4.1.3 总RNA提取和纯化  86-87
    4.1.4 提取RNA的质量检测  87
      4.1.4.1 RNA琼脂糖电泳  87
      4.1.4.2 RNA样品紫外比色  87
    4.1.5 cDNA合成和PCR扩增  87-88
    4.1.6 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染  88-90
      4.1.6.1 相关溶液  88
      4.1.6.2 变性PAGE凝胶的制备  88
      4.1.6.3 电泳  88-89
      4.1.6.4 染色  89-90
    4.1.7 表达条带统计  90
  4.2 结果与分析  90-105
    4.2.1 纯合状态下基因表达差异  90-97
      4.2.1.1 亲本之间基因表达差异  90-94
      4.2.1.2 转基因系及受体亲本不同时期基因表达差异  94-97
    4.2.2 杂合状态下转基因系基因差异表达研究  97-99
    4.2.3 纯合与杂合状态下基因表达差异比较  99-100
    4.2.4 基因表达差异与表型性状相关性  100-105
      4.2.4.1 产量性状与基因表达相关性  100-101
      4.2.4.2 纤维品质性状与基因表达相关性  101
      4.2.4.3 不同时期产量性状与基因表达相关性  101-102
      4.2.4.4 不同时期产量性状与基因表达相关性  102-105
  4.3 讨论  105-107
第五章外源基因整合对受体亲本影响的遗传效应研究  107-117
  5.1 材料和方法  107-108
    5.1.1 材料  107
    5.1.2 数据调查  107-108
    5.1.3 数据分析  108
  5.2 结果与分析  108-115
    5.2.1 遗传效应分解  108-113
    5.2.2 遗传效应分析  113-115
      5.2.2.1 dQTL加性效应分析  113
      5.2.2.2 各材料中dQTL纯合显性效应分析  113-114
      5.2.2.3 各材料中dQTL杂合显性效应分析  114
      5.2.2.4 各材料中遗传背景加性效应分析  114
      5.2.2.5 各材料中遗传背景纯合显性效应分析  114-115
      5.2.2.6 各材料遗传背景杂合显性效应分析  115
  5.3 讨论  115-117
参考文献  117-133
致谢  133-134
附录  134

外源基因整合及其对棉花受体亲本的影响

内容摘要

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