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粒细胞集落刺激因子治疗慢性缺血性心脏病实验研究

作　者: 黄榕翀
导　师: 葛均波；邹云增；张嘉宁
学　校: 复旦大学
专　业: 内科学
关键词: 模型，动物猪，模型心肌缺血慢性心肌缺血粒细胞集落刺激因子(G-CSF) 心脏功能心肌灌注显像存活心肌室壁运动单光子发射计算机体层扫描(SPECT)
分类号: R541
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

慢性缺血性心脏病作为冠心病的一种常见类型，常常引起心力衰竭导致死亡率增加。尽管药物治疗、介入手术及外科手术治疗进展很多，但是并不能真正挽救濒死心肌。近年来，大量动物实验和临床研究证实，干细胞移植可以改善急性心肌梗死后心脏功能，阻止心室重构，从而改善患者预后。粒细胞集落刺激因子（G-CSF）能够动员骨髓干细胞进入外周血，而心肌梗死后存在“自发归巢”作用有助于被动员的干细胞迁移至梗死相关区域。由于G-CSF治疗为非侵入性治疗，因此有可能更广泛应用于心肌梗死治疗。目前相关研究多局限于急性心肌梗死治疗，而对于慢性缺血性心脏病的研究尚少。本研究就是通过建立慢性缺血性心脏病动物模型，应用多种影像学手段，观察以不同剂量、不同动员时间窗及不同给药方式G-CSF治疗慢性缺血性心脏病前后心脏整体功能、局部功能和心肌微循环的变化，探索G-CSF治疗的剂量-疗效关系、时间-疗效关系以及最佳的给药方式等，并从安全性角度进行再评价，探讨G-CSF对慢性缺血性心脏病心脏功能影响的可能机制，从而为临床实际应用提供理论依据。第一部分慢性缺血性心脏病动物模型的建立与评价目的：利用开胸植入Ameroid动脉收缩环方法，制备慢性缺血性心脏病小型猪动物模型，应用多种临床影像学方法评价动物模型制备后不同时间心脏功能的变化，并从病理学角度观察心肌及血管组织变化，探讨该方法的可靠性和可重复性。方法：实验用小型猪21头，随机分为对照组（n=7）、4周组（n=7）和8周组（n=7）三组。三组动物均行开胸手术游离冠状动脉左回旋支主干，对照组为假手术组，不置入动脉收缩环。4周组和8周组动物均于左回旋支近段放置Ameroid动脉收缩环，制作左回旋支慢性闭塞的模型。按照事先制定的时间点行心电图、冠状动脉造影及左室造影检查、经胸超声心动图检查、潘生丁^99mTc-甲氧基异丁基异腈（MIBI）单光子发射计算机断层心肌灌注显像(^99mTc-MIBI-SPECT)及心血池显像、首过延迟心肌灌注磁共振扫描（CMR），评价左室功能、心肌损伤面积及心肌灌注面积的变化。术后4周（4周组）或8周（8周组）处死动物，分离血管和心肌行病理学检查。结果：21头实验小型猪中17头成活，并成功建立慢性心肌缺血模型猪11头。应用Ameroid动脉收缩环后，4周即可见左回旋支完全或次全闭塞。左室造影结果显示，4周时左室射血分数（LVEF）由术前73.4±2.3％下降至55.0±9.8％（p＜0.001），LVEF下降绝对值为17.9±6.8％：而到第8周时，LVEF下降更为显著，下降了24.4±3.1％：与对照组及4周组相比，8周组LVEF变化绝对值具有统计学意义（p＜0.001）。心脏超声检查结果发现动脉收缩环置入后，4周时左室舒张末直径（LVEDd）和左室收缩末直径（LVESd）即可以明显增加，回旋支供应节段室壁运动减弱。SPECT心肌显像提示左旋支支配范围（左心室侧壁或下壁）心肌灌注缺损面积增加（4周：12.8±2.6％；8周：17.5±4.0％），CMR及病理检查发现LCX支配范围内心肌坏死面积增加，伴凋亡心肌细胞数量增加及胶原增生。结论：应用Ameroid动脉收缩环4周后即可以成功制作慢性缺血性心脏病动物模型。第二部分粒细胞集落刺激因子（G-CSF）对慢性缺血性心脏病动物心脏功能及心室重构的影响第一节不同剂量G-CSF治疗慢性缺血性心脏病的实验研究目的：利用已经建立的慢性缺血性心脏病动物模型，观察不同剂量G-CSF动员对骨髓干细胞增殖的影响，以及不同剂量G-CSF与心脏功能变化的关系，探讨动员剂与干细胞移植的剂量-疗效关系。方法：24只猪成功制备慢性心肌缺血动物模型后，随机分为4组，分别是对照组（皮下注射等量生理盐水）、G-CSF低剂量治疗组（2.5μg／kg／d，皮下注射，连续5天）、G-CSF常规剂量治疗组（5μg／kg／d，皮下注射，连续5天）和G-CSF大剂量治疗组（10μg／kg／d，皮下注射，连续5天），每组6只。于动物模型制备后即刻及G-CSF动员后4周行心电图、冠状动脉造影及左室造影检查、经胸超声心动图检查、^99mTc-甲氧基异丁基异腈（MIBI）心肌核素显像(^99mTc-MIBI-SPECT)及心血池显像检查、^99mTC-甲氧基异丁基异腈（MIBI）／氟-18氟化去氧葡萄糖(¹⁸F-FDG)心肌双核素显像（DISA-SPECT）、首过延迟心肌灌注磁共振扫描（MRI）。比较心脏收缩和舒张功能、心肌损伤面积及心肌灌注面积的变化。G-CSF动员后4周处死动物，留取心肌及血管组织行病理学检查。结果：24只入组动物存活22只。G-CSF动员后，随G-CSF剂量增加，外周血中G-CSF浓度、白细胞、中性粒细胞和单核细胞计数峰值水平随之增加，峰值时间在动员后5—7天。流式细胞仪测定外周血CD34⁺／CD45⁺、CD34⁺／CD133⁺／CD45⁺比例变化，结果发现G-CSF动员后7天CD34⁺／CD45⁺、CD34⁺／CD133⁺／CD45⁺达到峰值水平，常规剂量组与大剂量组之间未见显著差别。冠状动脉造影结果发现，低剂量G-CSF治疗后动脉收缩环远段血管狭窄程度与对照组未见明显差别，常规剂量及大剂量组则明显改善。与对照组相比，接受G-CSF治疗的三组动物术后8周时，低剂量组和大剂量组动物LVEF没有下降（p＞0.05），但是亦未见明显改善，而常规剂量组动物LVEF显著改善，增加了10％左右，具有统计学意义（p＜0.001）。经胸心脏超声、SPECT及MRI等多种影像学检查方法得到同样结果。此外，不同剂量G-CSF治疗后E／A、Ea／Aa均显著升高，E／Ea下降，提示左室舒张功能均显著改善。G-CSF治疗还可以改善左室重构，减少梗死心肌面积，增加心肌灌注及存活心肌数量。不同剂量组之间相比，以常规剂量组改善最显著，大剂量组次之，低剂量组最差。结论：不同剂量G-CSF治疗慢性缺血性心脏病，均可以一定程度改善心脏功能，但是以5μg／kg／d改善最显著。第二节预防性G-CSF治疗对心脏的保护作用目的：利用已经建立的慢性缺血性心脏病动物模型，预防性应用G-CSF治疗，观察G-CSF是否可以延缓回旋支闭塞的时间及闭塞程度，以及预防性应用G-CSF对左室功能和心室重构的影响。方法：12只猪随机分为两组：对照组和G-CSF治疗组，每组6只。G-CSF治疗组在慢性缺血性心脏病动物模型制备后3小时即开始第一次皮下注射，5μg／kg／d，连续5天；而对照组同样时间连续注射等量生理盐水。于动物模型制备前及术后4周行冠状动脉造影及左室造影检查、^99mTc-甲氧基异丁基异腈（MIBI）心肌核素显像(^99mTc-MIBI-SPECT)及心血池显像检查、^99mTc-甲氧基异丁基异腈（MIBI）／氟-18氟化去氧葡萄糖(¹⁸F-FDG)心肌双核素显像（DISA-SPECT）、首过延迟心肌灌注磁共振扫描（MRI）。比较心脏LVEF、心肌损伤面积、心肌灌注面积及存活心肌的变化，并行病理学检查。结果：12只动物全部存活。G-CSF预处理可以延长血管闭塞的时间，并能减轻闭塞程度。SPECT结果显示，G-CSF预处理组动物术后4周时LVEF为61.0±3.5％，明显高于对照组（55.6±1.6％，p＜0.01）。MRI显示，G-CSF预处理后LVEF下降幅度远低于对照组（12.2±3.8％比18.8±2.3％，p＜0.01），两组LVEDV及LVESV均较术前显著增加，但是与对照组相比，G-CSF预处理组术后4周LVESV低（p＜0.05），而两组间LVEDV未见明显差别。G-CSF预处理还可以减少梗死心肌面积，减少心肌灌注缺损程度。结论：预防性应用G-CSF可以延缓慢性缺血性病变进展，降低血管狭窄程度。第三节经冠脉内直接注射粒细胞集落刺激因子治疗慢性缺血性心脏病的安全性和有效性评价目的：比较经冠脉内直接注射与皮下注射G-CSF两种不同途径对慢性缺血性心脏病动物心脏功能及左室重构的影响，并评价经冠脉内注射途径的安全性。方法：慢性缺血性心脏病动物模型制备后4周，存活18只猪。随机分为三组：对照组、G-CSF皮下注射组和G-CSF冠脉内注射组，每组6只。冠脉内注射组经冠脉内一次性注射足够剂量的G-CSF（60μg／kg），皮下注射组动物接受G-CSF 5μ／kg／d，连续5天注射，而对照组不做任何处理。于动物模型制备前、术后4周及术后8周行行冠状动脉造影及左室造影检查、^99mTc-甲氧基异丁基异腈（MIBI）心肌核素显像(^99mTc-MIBI-SPECT)及心血池显像检查、^99mTc-甲氧基异丁基异腈（MIBI）／氟-18氟化去氧葡萄糖(¹⁸F-FDG)心肌双核素显像（DISA-SPECT）、首过延迟心肌灌注磁共振扫描（MRI）。比较心脏LVEF、心肌损伤面积、心肌灌注面积及存活心肌的变化，并行病理学检查。结果：与皮下注射不同，冠脉内注射G-CSF后，外周血G-CSF峰值时间在动员后5天，而皮下注射后G-CSF峰值出现在动员后7天，但是两组间峰值水平未见显著差别（554.2±54.1pg／ml比590.8±87.9pg／ml，p＞0.05）。与皮下注射途径不同，冠脉内注射G-CSF后，猪外周血白细胞在1天后即开始显著升高达到峰值水平，其峰值水平低于皮下注射途径G-CSF动员后猪外周血白细胞峰值水平。流式细胞仪数据显示，与皮下注射途径相比，冠脉内注射G-CSF后，外周血CD34⁺细胞比例与CD34⁺／CD133⁺细胞比例同样升高，但两组间未见明显差别（p＞0.05）。与对照组相比，不同动员途径G-CSF治疗的两组动物回旋支远段血管狭窄程度均降低（P＜0.05），但两种动员途径未见明显差别。术后8周时，冠脉内注射组和皮下注射组动物LVEF均高于术后4周时LVEF（p＜0.01）；MRI结果发现，与对照组相比，不同途径G-CSF治疗后LVEF改善幅度均增加（对照组vs皮下注射组vs冠脉内注射组：-2.5±0.8％比5.8±1.2％比5.0±1.0％，p＜0.01），但两组间未见显著差别。同时，不同途径G-CSF治疗均可以改善左室重构，增加存活心肌数量，减少梗死心肌面积，但是两种途径间未见显著差别。结论：经冠脉内注射G-CSF安全，且可以改善慢性缺血性心脏病动物心脏功能。第四节G-CSF对慢性缺血性心脏病心脏功能影响的机制研究目的：本节通过研究不同剂量G-CSF动员后对血管新生、细胞凋亡及增殖、炎症免疫及动脉粥样硬化等影响探讨不同剂量G-CSF动员对心脏功能影响的可能机制。方法：24只猪成功制备慢性心肌缺血动物模型后，随机分为4组，分别是对照组（皮下注射等量生理盐水）、G-CSF低剂量治疗组（2.5μg／kg／d，皮下注射，连续5天）、G-CSF常规剂量治疗组（5μg／kg／d，皮下注射，连续5天）和G-CSF大剂量治疗组（10μg／kg／d，皮下注射，连续5天），每组6只。G-CSF动员后4周处死动物。双抗体夹心ELISA法测定血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α、血浆脑利钠肽（BNP）、高敏C-反应蛋白（hsCRP）、心肌肌钙蛋白T（cTnT）及G-CSF浓度，Western—blot、RT-PCR及免疫组化方法检测G-CSF对血管新生、细胞凋亡、增殖以及动脉粥样硬化相关蛋白及基因的影响。结果：常规剂量和大剂量G-CSF动员后，梗死区域心肌vWF、VEGF及MCP—1蛋白及相应基因mRNA表达水平明显增高，提示局部血管新生和细胞增殖增加，但是两剂量间未见明显差别。与对照组相比，低剂量G-CSF动员并不减少梗死边缘区凋亡心肌细胞数量，而常规剂量与大剂量G-CSF较其他两组凋亡心肌细胞数量显著减少，Western—blot及RT—PCR结果显示G-CSF治疗通过抑制心肌梗死后Akt下调水平减少细胞凋亡。此外，G-CSF动员可能促使hsCRP、TNF-α、S—100表达增加，导致大剂量组动物动脉粥样硬化程度加重。结论：G-CSF可能通过减少细胞凋亡、增加梗死区域血管新生及细胞增殖改善心脏功能；大剂量G-CSF可能增加局部炎症免疫反应，促进动脉粥样硬化进程而降低G-CSF的有益作用。

全文目录

中文摘要  8-14
英文摘要  14-21
引言  21-23
第一部分慢性缺血性心脏病动物模型的建立与评价  23-53
  前言  23
  1.材料  23-25
  2.实验方法  25-30
  3.结果  30-45
  讨论  45-46
  结论  46-47
  参考文献  47-53
第二部分粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对慢性缺血性心脏病动物心脏功能及心室重构的影响  53-120
  前言  53-54
  第一节不同剂量G-CSF治疗慢性缺血性心脏病的实验研究  54-78
    1.材料  54-55
    2.实验方法  55-59
    3.结果  59-78
  第二节预防性G-CSF治疗对心脏的保护作用  78-83
    1.材料  78
    2.实验方法  78-79
    3.结果  79-83
  第三节经冠脉内直接注射粒细胞集落刺激因子治疗慢性缺血性心脏病的安全性和有效性评价  83-93
    1.材料  83
    2.实验方法  83-85
    3.结果  85-93
  第四节 G-CSF对慢性缺血性心脏病心脏功能影响的机制研究  93-120
    1.材料  93-98
    2.实验方法  98-106
    3.结果  106-120
讨论  120-123
结论  123-125
参考文献  125-130
论文总结  130-131
综述  131-144
附件一在校期间发表主要文章目次  144-146
附件二在校期间获奖情况  146-147
致谢  147-149

粒细胞集落刺激因子治疗慢性缺血性心脏病实验研究

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