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谷胱甘肽过氧化物酶的人工模拟及其抗肿瘤活性研究

作　者: 郑克岩
导　师: 罗贵民
学　校: 吉林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 硒多糖 吉林大学 模拟物 含硒蛋白 蛋白多糖 博士论文 硒代半胱氨酸 活性研究 抗肿瘤效应 化学修饰
分类号: R730.5
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


硒为生物必需微量元素,在人类的生长发育过程中发挥重要的生理功能。生物体内,硒主要以三种形式存在:硒蛋白、硒多糖和硒核酸。研究表明,硒蛋白和硒多糖具有抗氧化、抗肿瘤、提高机体免疫力等生物学功能,对它们结构和作用机制的研究,可以为人类在医学保健上提供有用的资料,为人类的健康成长谋福。硒在人体内最重要的生理功能就是针对活性氧及其衍生物的抗氧化活性,从而构成人体的抗氧化防御体系。在哺乳动物体内,最重要的功能硒蛋白就是谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPX),它的主要功能是清除机体在新陈代谢过程中产生的氧自由基,保护细胞的膜结构,抗氧化损伤。晶体结构研究证明,硒以硒代半胱氨酸的形式定位在GPX的活性位点上,是GPX的活性基团,对它的酶活性起关键性的作用。硒多糖主要存在于一些植物和真菌体内,是人体最重要的硒补充剂,进一步研究发现,硒多糖还具有一些其它的功能,例如清除有害的金属离子、提高机体免疫力等。因此,对这两种有机硒化合物进行研究和开发,就成为科学工作者的研究热点。GPX在人体内具有重要的生理活性,但是它的不稳定性和资源局限性导致它的利用率很低,因此,开发具有高GPX活力的人工模拟物就成为研究的重点。人工模拟酶的关键是构建具有与天然酶相似的底物结合部位和活性中心结构。在以前化学合成的小分子模拟物的研究中发现,从仅考虑活性基团而不考虑底物结合位点到二者全部考虑,模拟物的GPX活力有大幅的提高,但是活力均小于天然酶,限制了它们的应用。我们利用天然酶为材料,通过化学修饰其活性位点的丝氨酸残基,得到了接近天然酶活力的GPX模拟物,提示我们这是一种理想的模拟方法。文献表明,谷胱甘肽硫转移酶(glutathione transferase,GST)与GPX具有共同的GSH结合位点,如果在它的活性中心上含有丝氨酸残基(Ser),我们利用化学修饰的方法将其转变为硒代半胱氨酸(Sec),则可能获得高GPX活力的模拟酶。通过对天然酶进行筛选,我们利用人zeta族谷胱甘肽硫转移酶(hGST Z1-1)作为模拟的蛋白骨架。hGST Z1-1的活性中心结构同GPX相似,并且其活性中心的开口处具有两个Ser残基,利于化学修饰和与底物结合,因此是一个理想的模拟材料。化学修饰后得到的Se-hGST Z1-1具有很高的GPX活性,是某些天然酶活力的1.5倍。结果表明进行酶模拟的关键是构建与天然酶相似的活性部位的微环境,这为我们将来的工作提供了理论依据。在开发小分子GPX模拟物的时候,我们惊喜地发现某些模拟物还具有其它的生理活性,其中硒化环糊精对肿瘤细胞的双重作用提示我们,它可以预防和治疗某些癌症,具有潜在的药用价值。2-硒桥联-β-环糊精(2-selenium-bridgedβ-cyclodextrin,2-SeCD)在低剂量时可以促进HeLa细胞的生长,2-SeCD起抗氧化保护细胞的作用;在高剂量时,引起HeLa细胞凋亡,2-SeCD此时为细胞内的GSH耗竭剂,细胞内GSH快速大量的消耗引起细胞内氧化还原态的变化,激活caspase-3,直接引起肿瘤细胞凋亡。2-SeCD的这种双重调节作用是因为其具有谷胱甘肽过氧化物酶、脱氢抗坏血酸还原酶、巯醇转移酶活性,在行使这些功能时,将大量的GSH转化成GSSG,改变了细胞内的氧化还原平衡导致细胞凋亡。硒多糖作为硒的一种功能性化合物由于其在自然界中含量很低,因此对它的化学合成及抗肿瘤活性研究就成为科学家的研究重点。我们利用研究GPX模拟物的化学修饰方法,将蛋白多糖的羟基用PMSF活化,然后用-SeH亲核取代活化的-OH,将硒连接到蛋白多糖分子上,得到具有抗氧化活性的硒化蛋白多糖。生物活性实验研究表明,它具有直接杀死肿瘤细胞的功能,并且还保留了原多糖的免疫增强作用。离体实验表明它的抗肿瘤活性是通过调整细胞内bcl-2和bax的比值来启动肿瘤细胞凋亡。

全文目录


提要  4-6
英文缩写词表  6-13
第一章 本论文立论依据  13-20
  1. 硒代谷胱甘肽硫转移酶模拟 GPX  15
  2. 2-硒桥-β-环糊精抗肿瘤效应及机制研究  15-16
  3. 硒化蛋白多糖制备及抗肿瘤活性研究  16
  参考文献  16-20
第二章 含硒谷胱甘肽硫转移酶模拟 GPX  20-41
  第一节 绪论  20-22
  第二节 含硒谷胱甘肽硫转移酶Zeta 1-1 模拟GPX  22-41
    一、实验材料  22-24
    二、实验方法  24-28
      2.1 GST zeta 1-1 和GST zeta mutant 表达  24-25
      2.2 蛋白纯化  25
      2.3 蛋白含量测定  25-26
      2.4 NaSeH 的制备  26
      2.5 硒化谷胱甘肽硫转移酶的制备  26
      2.6 硒含量的测定  26-27
      2.7 酶活力的测定  27
      2.8 稳态动力学研究  27-28
      2.9 统计学分析  28
    三、结果  28-33
      3.1 酶的纯度及收率  28-29
      3.2 含硒蛋白酶的制备和表征  29-30
      3.3 含硒蛋白酶的活力测定  30-31
      3.4 含硒蛋白酶的动力学分析  31-33
    四、讨论  33-35
    五、结论  35
    六、参考文献  35-41
第三章 2-硒桥联-β-环糊精抗肿瘤效应及机制研究  41-71
  第一节 绪论  41-42
  第二节 2-硒桥联-β-环糊精抗肿瘤活性研究  42-71
    一、实验材料  42-45
    二、实验方法  45-49
      2.1 细胞培养和生长抑制实验  45-46
      2.2 2-SeCD 的细胞毒性实验  46
      2.3 细胞形态学检测  46
      2.4 DNA提取及DNA片断检测  46
      2.5 caspase 活性分析  46-47
      2.6 细胞内GSH 含量测定  47
      2.7 细胞内蛋白巯醇含量测定  47-48
      2.8 脱氢抗坏血酸还原酶活力分析  48
      2.9 巯醇转移酶活力分析  48
      2.10 统计学分析  48-49
    三、结果  49-62
      3.1 2-SeCD 引起的HeLa 细胞生长抑制  49-51
      3.2 2-SeCD 诱导HeLa 细胞凋亡实验  51-54
      3.3 caspase-3 的活力测定  54-56
      3.4 细胞内GSH 含量测定  56-58
      3.5 细胞内蛋白硫醇测定  58-59
      3.6 鉴定2-SeCD 潜在的脱氢抗坏血酸还原酶活性  59-61
      3.7 鉴定2-SeCD 潜在的巯醇转移酶活性  61-62
    四、讨论  62-66
    五、结论  66
    六、参考文献  66-71
第四章 硒化蛋白多糖制备及抗肿瘤活性研究  71-93
  第一节 绪论  71-72
  第二节 蛋白多糖硒化及性质研究  72-93
    一、实验材料  72-76
    二、实验方法  76-81
      2.1 蛋白多糖硒化  76-77
        2.1.1 NaSeH 的制备  76
        2.1.2 蛋白多糖硒化  76-77
        2.1.3 硒含量测定  77
        2.1.4 GPX 活性测定  77
      2.2 GTP 蛋白多糖及硒化GTP 抗肿瘤活性的研究  77-81
        2.2.1 GTP 蛋白多糖整体抗肿瘤实验方法  77-78
        2.2.2 NK 细胞活性的测定  78
        2.2.3 小鼠脾淋巴细胞增殖的实验  78
        2.2.4 IL-2 活性测定实验  78-79
        2.2.5 体外诱导肿瘤坏死因子TNFα的产生实验  79-80
          2.2.5.1 用鲎试剂方法定量样品本身内毒素含量  79
          2.2.5.2 用GTP 处理THP-1 细胞  79
          2.2.5.3 TNFα的含量测定  79-80
          2.2.5.4 体外诱导肿瘤细胞死亡实验  80
        2.2.6 RT-PCR 实验  80-81
          2.2.6.1 GTP 处理后的THP-1 细胞的总RNA 的提取  80
          2.2.6.2 互补链cDNA 的合成  80
          2.2.6.3 PCR 反应  80-81
          2.2.6.4 水平板电泳  81
        2.2.7 统计学处理  81
    三、实验结果  81-88
      3.1 硒化蛋白多糖Se-GTP 的硒含量  81
      3.2 硒化蛋白多糖Se-GTP 的GPX活力测定  81-82
      3.3 GTP 蛋白多糖抗肿瘤活性的研究  82-85
        3.3.1 GTP 蛋白多糖整体抗肿瘤实验  82
        3.3.2 GTP对NK细胞活性的增强作用  82-83
        3.3.3 GTP 对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响  83
        3.3.4 GTP 对IL-2 产生的增强作用  83-84
        3.3.5 GTP 诱导TNFα的产生及TNFαmRNA 的表达  84-85
          3.3.5.1 鲎试剂定量样品内毒素含量  84
          3.3.5.2 GTP对人组织巨噬细胞瘤THP-1细胞产生TNFα的影响  84-85
          3.3.5.3 GTP 诱导肿瘤坏死因子TNFαmRNA 的表达  85
      3.4 Se-GTP 抗肿瘤活性的研究  85-88
        3.4.1 Se-GTP 体外诱导肿瘤细胞死亡实验  85-87
        3.4.2 Se-GTP 诱导肿瘤细胞死亡机制研究  87
        3.4.3 Se-GTP 免疫活性的研究  87-88
          3.4.3.1 Se-GTP 对NK 细胞活性的增强作用  87-88
          3.4.3.2 Se-GTP 对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响  88
    四、讨论  88-90
    五、结论  90
    六、参考文献  90-93
第五章 文献综述  93-167
  第一节 硒的生物学功能  93-102
  第二节 谷胱甘肽过氧化物酶的人工模拟  102-121
  第三节 硒多糖的生物功能研究及应用  121-128
  第四节 含硒生物大分子的抗肿瘤作用  128-167
中文摘要  167-171
英文摘要  171-175

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题 > 肿瘤治疗学
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