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大鼠内耳感觉上皮细胞原代培养体系及椭圆囊感觉上皮细胞永生化细胞系的建立与毛细胞再生

作　者: 刘俊
导　师: 孔维佳
学　校: 华中科技大学
专　业: 耳鼻咽喉科
关键词: 耳蜗感觉上皮原代培养毛细胞支持细胞再生椭圆囊猿猴肉瘤病毒细胞系生长因子
分类号: R764
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

研究发现鸟类及低等脊椎动物内耳毛细胞损伤后可以再生。哺乳动物椭圆囊毛细胞损伤后亦可再生,但程度很低。鸟内耳在氨基糖苷类抗生素及声损伤后,其内耳支持细胞分裂增殖活跃;免疫组化和放射自显影技术也发现再生的毛细胞合成的DNA含有BrdU标记物。这表明支持细胞能被诱导分裂并分化为新的毛细胞,支持细胞是毛细胞最可能前体细胞。内耳感觉上皮支持细胞的分裂增殖及支持细胞直接形态转化是毛细胞再生的主要步骤。对内耳感觉上皮的毛细胞发展、分化及再生机制的研究,因内耳结构复杂、组织来源少而受到一定限制。建立内耳感觉上皮细胞原代培养及永生化细胞系是一个有效的解决途径,可用于研究各种生长因子对支持细胞分裂增殖及毛细胞再生的影响。本实验成功地建立了大鼠耳蜗及椭圆囊感觉上皮细胞的原代培养体系;并通过基因转染技术,应用SV40 T抗原建立了大鼠椭圆囊感觉上皮细胞永生化细胞系;对其形态特征及向毛细胞分化的可能性进行了初步研究。第一部分大鼠耳蜗感觉上皮细胞的原代培养目的:建立大鼠耳蜗感觉上皮细胞(Cochlear sensory epithelial cell,CSEC)的原代培养体系,为内耳感觉上皮细胞培养及毛细胞再生机制的研究打下基础。方法:取出生1天(postnatal day 1,P1)大鼠耳蜗感觉上皮(corti器)作组织块培养,经选择性消化抑制成纤维样细胞(Fibroblast-like cell,FLC)生长。从第2天开始每日倒置显微镜观察,选特征性的表现照相。应用有限稀释法纯化CSEC,经过对CSEC的形态、生长特征的观察;细胞角蛋白18、波形蛋白、Brn3.a、Calretinin的免疫细胞化学及透射电镜等方法鉴定CSEC。BrdU标记CSEC核DNA观察CSEC细胞有丝分裂活动。结果:新鲜组织块淡黄色,在倒置显微镜下,不易分辨细胞的轮廓。培养第2天CSEC从组织块迁移出来,FLC呈梭形“鱼群样”包绕CSEC生长,增殖速度快于CSEC。纯化的CSEC呈扁平、多角形、核大而圆的上皮细胞形态,形成单层时呈“铺路石样”外观,细胞之间连接紧密,可见由成百上千个CSEC包绕液体而成的dome。原代CSEC表达细胞角蛋白和波形蛋白,微绒毛丰富,细胞间连接紧密提示其上皮起源。CSEC表达毛细胞的特征性标志物Brn3.a、Calretinin。证实了培养CSEC具有毛细胞前体细胞的特征。BrdU细胞核标记,证实培养细胞具有明显增殖活性,并通过有丝分裂活动产生新的细胞。结论:离体培养的CSEC表达毛细胞的特征性标志物,具有毛细胞前体细胞的特征即毛细胞样细胞。CSEC原代培养体系的建立,为进一步探讨毛细胞再生的分子机制提供良好的、充足的研究材料。第二部分大鼠椭圆囊感觉上皮细胞的原代培养目的:建立大鼠椭圆囊感觉上皮细胞(Utricular sensory epithelial cell,USEC)的原代培养体系,为研究毛细胞再生等机制提供大量来源一致的细胞。方法:取出生1天(postnatal day 1,P1)大鼠的椭圆囊感觉上皮,嗜热菌蛋白酶(thermolysin)消化处理,获得纯椭圆囊感觉上皮,再采用消化法进行原代培养,培养基为DMEM。从第2天开始每日倒置显微镜观察,选特征性的表现照相。经过对USEC的形态、生长特征的观察;透射电镜;细胞角蛋白18、波形蛋白免疫细胞化学等方法鉴定USEC来源;应用免疫细胞化学及RT-PCR分别检测毛细胞的特征性标志物Calretinin、Brn3a和AchRa9、MyosinⅦa mRNA的表达。结果:原代培养USEC呈扁平、多角形、核大而圆的上皮细胞形态,细胞之间连接紧密,形成单层时呈“铺路石样”外观。可见由成百个USEC包绕液体而成的dome。原代USEC表达细胞角蛋白不表达波形蛋白,微绒毛丰富,细胞间连接紧密,提示其上皮起源:表达毛细胞的特征性标志物Brn3.a、Calretinin及AchRa9、MyosinⅦa mRNA,表明培养USEC具有毛细胞前体细胞的特征。结论:原代培养的USEC表达毛细胞的特征性标志物,具有毛细胞前体细胞的特征。USEC原代培养体系的建立,为进一步探讨毛细胞再生的机制提供充足的细胞来源。第三部分应用猿猴病毒SV40 T抗原建立大鼠椭圆囊感觉上皮细胞永生化细胞系目的:建立大鼠椭圆囊感觉上皮细胞(utricular sensory epithelial cell,USEC)永生化细胞系(USEC-1),为毛细胞分裂、分化、再生及基因表达、信号转导等机制研究奠定基础。方法:取出生1天(postnatal day 1,P1)大鼠的椭圆囊感觉上皮,嗜热菌蛋白酶(thermolysin)消化处理,获得纯椭圆囊感觉上皮;再采用胰酶+胶原酶消化,获得具活性的纯椭圆囊感觉上皮细胞,接种培养板培养3天,培养基为DMEM。然后加入猿猴肉瘤病毒SV40(Simian Virus,SV40),在无血清条件下共培养,转染3天,2%胎牛血清选择培养3天,通过行态学及增殖能力的变化粗筛出USEC-1细胞系。并通过对细胞系的行态、生长特征;细胞角蛋白18、波形蛋白的免疫组化;透射电镜;RT-PCR检测SV40 T抗原。细胞计数、USEC-1细胞对生长因子bFGF反应、流式细胞仪等检测USEC-1细胞的增殖能力,软琼脂糖培养,裸鼠致瘤试验来鉴定永生化细胞系USEC-1。结果:USEC-1细胞系保持了原代细胞的表形特征,呈扁平、多角形、核大而圆的上皮细胞形态,细胞之间连接紧密,形成单层时呈“铺路石样”外观。可见由成百个USEC-1细胞包绕液体而成的dome。细胞角蛋白表达阳性,波形蛋白表达阴性。不同世代USEC-1均表达SV40 T抗原。该系已培养6个月,已传25代,传代时间为5-6天,传代比为1:2-3。液氮中保存不同世代的细胞。USEC-1细胞在无血清培养基中能正常生长,增殖能力并随着bFGF浓度的增加而增强。软琼脂糖培养、裸鼠致瘤试验阴性。结论:本实验成功建立了大鼠椭圆囊上皮细胞永生化细胞系USEC-1,并进行了初步的鉴定。本细胞系基本上保留了原代USEC细胞的表形特征,又不具有瘤细胞特征,为在体外研究毛细胞分裂、分化、再生及内耳分子遗传机制提供了新的途径和细胞来源。第四部分大鼠椭圆囊感觉上皮细胞系USEC-1毛细胞标志物表达的鉴定目的:通过研究USEC-1细胞毛细胞标志物的表达及向毛细胞分化的可能性,来探讨毛细胞再生机制。方法:培养USEC-1细胞,培养基为含100ng/ml bFGF的无血清DMEM。应用免疫细胞化学、Western blot检测毛细胞的特征性标志物Calretinin、Brn3a;RT-PCR检测毛细胞标志物AchRa9、MyosinⅦa蛋白mRNA的表达。结果:USEC-1在一定条件下(bFGF诱导)表达毛细胞的特征性标志物Brn3.a、Calretinin及AchRa9、MyosinⅦa蛋白mRNA,且细胞形态由多角形变长呈扁平梭形似成纤维细胞状,表明USEC-1细胞经历增殖、分化并可能向毛细胞转化。结论:USEC-1在一定条件下表达毛细胞的特征性标志物,具有毛细胞前体细胞的特征,可用于毛细胞再生机制研究。

全文目录

英文缩写索引  5-6
前言  6-12
中文摘要  12-16
英文摘要  16-22
正文  22-90
  第一部分大鼠耳蜗感觉上皮细胞的原代培养  22-35
    材料与方法  22-25
    结果  25-26
    讨论  26-29
    参考文献  29-35
  第二部分大鼠椭圆囊感觉上皮细胞的原代培养  35-49
    材料与方法  35-39
    结果  39-40
    讨论  40-43
    参考文献  43-49
  第三部分应用猿猴病毒SV40 T抗原建立大鼠椭圆囊感觉上永生化皮细系  49-74
    材料与方法  50-57
    结果  57-59
    讨论  59-63
    参考文献  63-74
  第四部分大鼠椭圆囊感觉上皮细胞系USEC-1毛细胞标志物表达的鉴定  74-90
    材料与方法  74-80
    结果  80-81
    讨论  81-84
    参考文献  84-90
综述哺乳动物内耳毛细胞再生的机制及其调控与影响因素  90-108
读博期间已发表或待发表的论文  108-109
致谢  109

大鼠内耳感觉上皮细胞原代培养体系及椭圆囊感觉上皮细胞永生化细胞系的建立与毛细胞再生

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