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肠道微生物多样性及其与人体代谢相关性的研究

作　者: 王保红
导　师: 李兰娟
学　校: 浙江大学
专　业: 内科学
关键词: 肠道微生物多样性代谢表型多变量数据分析正交偏最小二乘法
分类号: R574
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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引　用: 3次
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内容摘要

人体肠道微生物组是人体最庞大而复杂的微生物群落，也是人体的一个重要的代谢“器官”。在哺乳动物中，肠道微生物在营养物质的摄取、上皮细胞的生长发育、免疫及药物的代谢和毒性方面起重要作用。由于大多数微生物很难或不能用现有技术分离培养，阻碍了人们对其认识。随着分子生态学技术的发展，越来越多的尚未能培养的微生物的基因得到了认识。但是对这些尚未得到纯培养的微生物的分类地位与其功能进行关联，及不同时间、居住环境、饮食和性别等对其的影响还未得到关注。此外，肠道微生物与宿主的相互作用机制及关键功能菌的研究也很缺乏。本研究采用16S rRNA克隆文库技术对中国一家庭的7位健康成员的肠道微生物的多样性进行了全面的认识，共检测7，255条16S rRNA基因全长序列。根据99％的序列相似性，将这些基因序列共划分476个进化型(phylotypes)，其中273个新的进化型；系统发育地位上分属6大菌门：壁厚菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、梭杆菌门(Fusobacteria)，与Eckburg、Gill小组等报道结果基本一致。认识肠道微生物是阐明其与人体健康和疾病关系的第一步。为进一步研究可能影响人体肠道微生物多样性的潜在因素如生活环境、性别和饮食习惯等，本研究运用生物信息学、生态数据分析和多变量数据统计分析等手段，将此家庭的序列数据集与Science杂志已报道的5位美国个体的序列数据集一起，共11，656条16S rRNA全长序列，根据99％的序列相似性，共划分为854个进化型。通过∫-Libshuff分析，结果表明此中国健康家庭成员的肠道菌群组成每个个体间均有显著性差异；与已报道的5位美国个体的肠道菌群结构相比较，发现在门的水平上，结构和组成基本相似；在种的水平上，这两个队列间存在显著的差异；此外，还发现肠道微生物组成结构与性别显著相关。大量研究发现微生物区系的功能通常会随着其组成同时发生变化。Nicholson小组发现中国人群与美国人群代谢表型存在显著性差异，而我们的研究结果发现7位中国个体与5位美国个体的肠道微生物的组成存在显著性差异，因此我们得到这样一个问题：此肠道微生物组成的差异是否与其各自的代谢表型存在关联呢?我们可以根据这一模式深入探索微生物组的组成与代谢表型动态变化，寻找潜在的共变异，鉴定与宿主互作过程中关键的功能菌，揭示宿主与共生微生物潜在的互作机制。因此，对此家庭的肠道微生物整体结构研究之后，我们运用基于PCR-DGGE(变性胶梯度电泳)指纹图谱技术监测家庭成员肠道微生物组的组成结构整体变化；运用基于~1H NMR代谢组学技术监测尿液代谢组谱变化；最后运用基于多变量统计分析方法—正交偏最小二乘法(OPLS)，将此家庭成员的一个月时间间隔的整体代谢变化，同其肠道菌群结构和组成变化进行整体关联分析，研究结果表明此家庭的肠道微生物组成结构与宿主的尿液代谢表型间存在关联；此外，此家庭成员的肠道菌群和代谢都与性别显著相关。通过多变量数据统计分析，我们发现与人体代谢显著相关的潜在的关键功能菌，经过鉴定发现与这些主要的功能菌最近缘的进化型为B. thetaiotaomicron, B. uniformis, B. coprocola, Pseudobutyrivibrio rumints. bacterium mpn-isolate group 25, Rum. bromii, Faecalibacterium prausnitzii 1-88, Subdoligranulum variable BI-114, Bifidobacterium. pseudocatenula等，主要属于拟杆菌属和梭菌属；尤其Faecalibacterium prausnitzii与8种代谢物质相关；通过对与性别显著相关的条带进行测序分析，发现与其最近缘的进化型为：Eubacterium cligens, Ruminococcus obeum, Klebsiella pneumoniae, Sutterella stercoricanis, Bacteroides thetaiotaomicron, Ruminococcus bromii。同时通过NMR二维谱对关联分析找到的与功能菌相关的代谢物进行签定。其中很多代谢物质为肠道微生物或肠道微生物与宿主共代谢的产物如phenylacetylglutamine(笨乙酰基-谷氨酸盐)，4-cresol sulphate(4-甲酚硫酸盐)，4-hydroxyphenylacetate(4-羟基-乙酸苯酯)。本研究对中国一四代家庭7位成员的肠道菌群进行了全面的认识；运用多变量数据分析，将肠道菌群结构和组成变化与人体尿样代谢谱进行共变异分析；并提出一个新的研究策略从复杂的肠道微生物中寻找关键的功能菌，国内外尚未见类似报道。肠道微生物可以影响人体代谢表型这一现象的发现也为个体化诊疗提供新的研究线索和理论依据。此研究策略也可以应用于探索肠道微生物与宿主的共代谢过程，研究肠道微生物与宿主潜在的相互作用机制及寻找人体健康或疾病的生物标志物。“肠道微生物与人体的代谢的相关性”这一发现也为Gordon小组的最新发现“肠道微生物与肥胖有关”提供了新的佐证。

全文目录

中文摘要  3-7
Abstract  7-12
创新点  12-13
目录  13-15
引言  15-18
第一部分中国—四代家庭成员肠道菌群多样性分析  18-34
  1.1 材料和方法  18-24
    1.1.1 研究对象  18-19
    1.1.2 采样、样品前处理、DNA提取  19-20
    1.1.3 16S rDNA全长扩增,克隆文库构建  20-21
    1.1.4.克隆文库测序  21
    1.1.5.克隆文库分析  21-24
    1.1.6.多变量分析  24
  1.2 实验结果  24-34
    1.2.1 16S rDNA全长扩增,克隆文库构建  24-25
    1.2.2 克隆文库测序  25
    1.2.3.克隆文库分析  25-32
    1.2.4.核酸序列登录号(Accession number)  32
    1.2.5.多变量分析  32-34
第二部分中国—四代家庭成员肠道菌群和尿液代谢谱动态变化监测  34-52
  2.1 材料和方法  34-41
    2.1.1.16S rDNA V3区扩增及各类群特异性扩增  34-36
    2.1.2.变性梯度凝胶电泳(DGGE)电泳  36-37
    2.1.3.DGGE电泳图谱分析  37-38
    2.1.4 尿液~1H NMR谱分析  38-39
    2.1.5 GC-MS分析  39-40
      2.1.5.1.GC-MS分析前样品处理  39-40
      2.1.5.2.GC-MS分析上机分析过程  40
    2.1.6 代谢组学数据多变量分析  40-41
  2.2 实验结果  41-52
    2.2.1 PCR-DGGE指纹图谱分析参数  41-42
      2.2.1.1 DGGE指纹图谱胶梯度范围的确定  41
      2.2.1.2 DGGE泳道(Lane)安排  41-42
    2.2.2 16S rDNA V3区及各类群特异性DGGE图谱分析结果  42-52
第三部分肠道微生物与代谢谱的关联分析  52-62
  3.1 材料和方法  52-55
    3.1.1 数据前处理  52
    3.1.2 多变量分析:  52-54
    3.1.3.代谢物鉴定  54
    3.1.4.关键功能菌的鉴定  54-55
    3.1.5 核酸序列登录号(Accession number)  55
  3.2 肠道菌群结构组成与代谢的关联分析结果  55-62
    3.2.1 V3区与尿液~1HNMR代谢谱的关联  55-57
    3.2.2 梭菌属与尿液NMR代谢谱关联分析  57-59
    3.2.3 与代谢表型显著相关的功能菌及相关代谢物  59-62
第四部分讨论  62-71
  4.1 人体肠道微生物多样性  62-63
  4.2 肠道菌群的个体特异性  63-64
  4.3 肠道微生物组与性别  64
  4.4 肠道微生物研究策略  64-65
  4.5 本研究策略  65-66
  4.6 肠道微生物研究意义  66-68
  参考文献 References  68-71
第五部分综述  71-92
  5.1 肠道微生物研究进展  71-87
    5.1.1 肠道微生物研究概述  71-72
    5.1.2 人体肠道微生物的分布  72-73
    5.1.3 肠道微生物的多样性  73-74
    5.1.4 肠道微生物的功能  74-77
    5.1.5 肠道微生物的主要影响因素  77-79
    5.1.6 研究现况、研究方法及最新研究技术进展  79-84
    5.1.7 微生物与人体健康和疾病  84-86
    5.1.8 肠道微生态的研究前景  86-87
  参考文献 References:  87-92
附录1、简称缩写  92-93
附录2.溶液试剂及培养基  93-94
附录3.实验中所用的仪器设备  94-95
致谢  95-96
已(待)发表的学术论文及参与的科研项目  96-97

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