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聚丙烯微孔膜表面的糖基化研究

作　者: 杨谦
导　师: 徐志康
学　校: 浙江大学
专　业: 高分子化学与物理
关键词: 聚丙烯微孔膜 含糖聚合物 紫外辐照接枝聚合 原子转移自由基聚合 抗非特异性吸附 特异性识别 伴刀豆球蛋白
分类号: TQ320.721
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
下　载: 430次
引　用: 4次
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内容摘要


糖类广泛存在于生物体中，并且对许多生理过程如：凝血、免疫应答、受精、细胞生长、胚胎形成以及细胞间信息传递等起着至关重要的作用。几乎所有的细胞膜表面都有糖，它们以聚糖、糖蛋白以及糖肽等糖缀合物的形式在细胞膜外表面形成被称为“糖被”的致密糖基化层。“糖被”的功能可以分为两个方面：一是作为保护层，防止外界蛋白质等生物分子在细胞膜上的非特异性吸附；另一方面是利用糖基与蛋白质的特异性相互作用，作为细胞或者其它生物分子的识别位点。本文建立了一系列方法对聚丙烯微孔膜表面进行糖基化，实现对细胞膜表面“糖被”层的模拟，希望聚丙烯微孔膜表面的糖基化层能够具有类似“糖被”层的抗非特异性吸附和特异性识别的能力。合成了两种分别含有直链和环状葡萄糖基的含糖单体甲基丙烯酸-2-葡萄糖酰胺乙酯(GAMA)和α-烯丙基葡萄糖(AG)。通过紫外辐照引发这两种含糖单体的接枝聚合，实现了聚丙烯微孔膜表面的糖基化。接枝聚合过程可以通过改变单体浓度、紫外辐照时间以及光引发剂浓度来进行调控。接枝密度随着单体浓度的提高而增大，但单体浓度达到一定值后接枝密度不再增加。紫外辐照时间增加能够显著提高接枝密度，但当辐照时间超过25分钟后，接枝密度基本保持不变。接枝密度随光引发剂浓度先增大后减小。采用表面衰减全反射傅立叶变换红外光谱(FT-IR／ATR)、X射线光电子能谱(XPS)以及扫描电子显微镜(SEM)对糖基化前后膜表面的化学结构以及形貌变化进行了表征，验证了膜表面糖基化的实现。水接触角的减小说明糖基化改善了膜表面的亲水性。同时发现，直链糖基化膜表面较环状糖基化膜表面水接触角小，说明直链糖基对亲水性的改善能力强于环状糖基。建立了两种新颖的聚丙烯膜表面糖基化方法，分别利用甲基丙烯酸-2-氨乙酯盐酸盐(AEMA)和丙烯酰胺(AAm)作为官能单体，通过紫外辐照引发其接枝聚合，将含有活性官能团的聚合物接枝到聚丙烯膜表面，再利用接枝链上官能基团的反应对糖基进行固定。PAEMA接枝后直接利用三乙胺对氨基进行脱保护，再与葡萄糖-δ-内酯反应，固定糖基。而PAAm接枝后先通过Hofmann重排反应将酰胺基团转化为活性初级氨基，然后再与葡萄糖-δ-内酯反应，固定糖基。由于接枝聚合活性的差异，PAAm的接枝密度远高于PAEMA，而随后糖基的固定量也相对较高。但由于高接枝密度造成接枝链堆积紧密，PAAm接枝链上官能团固定糖基的效率随着接枝密度的提高而显著降低。而PAEMA由于接枝密度较低，接枝链空间堆积较稀疏，固定糖基的效率随接枝密度变化较小，基本保持在80％左右。FT-IR／ATR、XPS以及SEM对糖基化前后膜表面的化学结构以及形貌变化的表征，验证了糖基化各步的完成。水接触角随时间变化实验揭示了不同性质接枝层对膜表面浸润和渗透性能的影响。通过在膜表面固定不同结构的原子转移自由基聚合(ATRP)引发基团，成功实现了聚丙烯微孔膜表面的可控糖基化，引入了聚合度可控的梳状和线形含糖聚合物接枝层。利用紫外辐照在聚丙烯膜表面接枝聚合甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)，再通过HEMA接枝链上的羟基固定2-溴丙酰溴，形成梳状大分子引发剂，引发含糖单体GAMA的ATRP接枝聚合，得到链长可控的梳状含糖聚合物接枝层。在溴的四氯化碳溶液中对聚丙烯膜进行紫外辐照，将溴原子引入膜表面。利用膜表面固定的溴原子，引发含糖单体GAMA的ATRP接枝聚合，得到链长可控的线形含糖聚合物接枝层。含糖聚合物接枝链的聚合度随着聚合时间的增加逐步提高。提高聚合体系中水的含量可以显著加快聚合速率，但同时聚合的可控性降低。而溴化铜的加入则减慢聚合速率但能够显著提高聚合过程的可控性。采用FT-IR／ATR、XPS以及原子力显微镜(AFM)表征阐明了可控糖基化各步前后膜表面的化学结构以及形貌的变化。分别考察了直链葡萄糖基化和环状葡萄糖糖基化聚丙烯微孔膜的抗非特异性吸附和特异性识别功能。牛血清蛋白(BSA)静态吸附、BSA溶液动态过滤、血小板黏附等实验证实了直链葡萄糖基化聚丙烯膜表面的抗非特异性吸附能力。实验表明，直链葡萄糖糖基化聚丙烯膜具有良好的抗BSA静态吸附的能力，梳状接枝链比线形接枝链具有更好的抗非特异性吸附效果。糖基化后膜的其抗动态蛋白质污染能力显著提高。接枝密度212.24μg／cm~2的直链葡萄糖基化聚丙烯膜的BSA溶液通量达到未改性膜的5倍。同时，糖基化膜的通量下降率降低，而通量恢复率均高于80％，说明糖基化后膜表面的蛋白质可逆吸附比例提高。血小板在未改性膜表面大量黏附，而经过糖基化后，膜表面黏附血小板数量明显减少，进一步证明糖基化表面优良的抗非特异性吸附能力。伴刀豆球蛋白(Con A)、荧光标记伴刀豆球蛋白(FL-Con A)以及荧光标记花生凝集素(FL-PNA)的识别吸附以及脱吸附实验证实了环状葡萄糖基化聚丙烯膜表面的特异性识别能力。Con A识别实验发现环状葡萄糖基化膜表面对其具有识别能力，识别效果与糖基密度关系密切，糖基化表面对Con A表现出明显的“集簇效应”，而且识别过程对锰离子和钙离子具有依赖性。FL-Con A识别实验进一步直观地证实了糖基化表面对特定蛋白质的识别作用。糖基化膜表面对FL-PNA无特异性识别作用，且表现出抗非特异性吸附的效果，从侧面证明了环状葡萄糖基对Con A的特异性识别。FL-Con A的脱吸附实验证实了高浓度葡萄糖和甘露糖溶液对识别作用有明显的抑制效果，而半乳糖溶液对识别作用没有抑制效果，进一步证实了环状葡萄糖基化膜表面与Con A的特异性识别作用。

全文目录


摘要  4-7
Abstract  7-16
第一章 绪论  16-42
  1.1 概述  16-17
  1.2 糖的生物功能  17-26
    1.2.1 糖的分类  17-18
    1.2.2 糖的功能  18-22
      1.2.2.1 供给能量  19
      1.2.2.2 结构功能  19
      1.2.2.3 免疫调节作用  19-20
      1.2.2.4 信息存储、传导与识别功能  20-22
    1.2.3 糖与蛋白质的特异性识别作用  22-26
      1.2.3.1 基本原理  22-23
      1.2.3.2 糖的集簇效应  23-25
      1.2.3.3 与糖识别的蛋白质  25-26
  1.3 材料表面接枝改性方法  26-38
    1.3.1 等离子体处理  27-28
    1.3.2 紫外辐照  28-31
    1.3.3 γ-射线辐射接枝  31
    1.3.4 臭氧处理法  31-32
    1.3.5 可控/活性接枝聚合  32-38
      1.3.5.1 可控/活性离子接枝聚合  32-33
      1.3.5.2 可控/活性自由基接枝聚合  33-38
        1.3.5.2.1 ATRP方法  33-35
        1.3.5.2.2 反向ATRP方法  35-36
        1.3.5.2.3 RAFT方法  36-38
  1.4 课题提出  38-42
    1.4.1 聚丙烯分离膜  38
    1.4.2 课题的提出  38-40
    1.4.3 研究内容及实验方案  40-42
      1.4.3.1 聚丙烯微孔膜表面糖基化方法的建立  40
      1.4.3.2 糖基化聚丙烯膜表面仿生功能的模拟  40-42
第二章 实验部分  42-64
  2.1 实验仪器设备  42-43
  2.2 实验原料  43-45
  2.3 含糖单体的合成  45-48
    2.3.1 烯丙基葡萄糖(AG)的合成  45-46
    2.3.2 甲基丙烯酸-2-葡萄糖酰胺乙酯(GAMA)的合成  46-47
      2.3.2.1 乙醇胺盐酸盐的合成  46-47
      2.3.2.2 甲基丙烯酸-2-氨乙酯盐酸盐的合成(AEMA)  47
      2.3.2.3 合成甲基丙烯酸-2-葡萄糖酰胺乙酯  47
    2.3.3 含糖单体的表征  47-48
      2.3.3.1 红外光谱分析  47-48
      2.3.3.2 核磁共振分析  48
      2.3.3.3 ESI质谱分析  48
  2.4 聚丙烯微孔膜表面的糖基化方法的建立  48-55
    2.4.1 紫外辐照引发含糖单体接枝聚合法  48
    2.4.2 官能单体接枝聚合后化学反应固定糖基法  48-52
      2.4.2.1 甲基丙烯酸-2-氨乙酯盐酸盐官能单体法  48-49
        2.4.2.1.1 紫外辐照引发AEMA接枝聚合  49
        2.4.2.1.2 PAEMA接枝聚丙烯膜的糖基化  49
        2.4.2.1.3 PAEMA接枝聚丙烯膜糖基化率的计算  49
      2.4.2.2 丙烯酰胺官能单体法  49-52
        2.4.2.2.1 紫外辐照引发AAm接枝聚合  49-50
        2.4.2.2.2 PAAm接枝链的Hofmann重排反应  50
        2.4.2.2.3 Ninhydrin法测定膜表面初级氨基的摩尔质量  50-51
        2.4.2.2.4 Hofmann重排反应的效率  51
        2.4.2.2.5 重排膜表面的糖基化  51
        2.4.2.2.6 膜表面初级氨基糖基化率的计算  51-52
    2.4.3 聚丙烯膜表面的可控糖基化  52-55
      2.4.3.1 膜表面梳状可控糖基层的构建  52-53
        2.4.3.1.1 紫外辐照引发甲基丙烯酸-2-羟乙酯(HEMA)接枝聚合  52
        2.4.3.1.2 ATRP引发剂在膜表面的固定  52
        2.4.3.1.3 膜表面引发的含糖单体ATRP接枝聚合  52-53
        2.4.3.1.4 含糖聚合物接枝链聚合度的计算  53
      2.4.3.2 膜表面线形可控糖基层的构建  53-55
        2.4.3.2.1 膜表面的溴化  53-54
        2.4.3.2.2 膜表面引发含糖单体ATRP接枝聚合  54
        2.4.3.2.3 含糖聚合物接枝链聚合度的计算  54-55
  2.5 糖基化膜表面的表征  55-57
    2.5.1 FT-IR/ATR分析  55
    2.5.2 X-射线光电子能谱分析  55
    2.5.3 扫描电子显微镜(SEM)分析  55-56
    2.5.4 原子力显微镜(AFM)分析  56
    2.5.5 膜表面水接触角的测定  56
    2.5.6 膜气通量的测量  56-57
  2.6 糖基化聚丙烯膜表面的仿生功能  57-64
    2.6.1 糖基化聚丙烯膜表面的抗非特异性吸附能力  57-61
      2.6.1.1 BSA溶液的静态吸附实验  57-59
        2.6.1.1.1 BSA磷酸盐缓冲溶液(PBS)的配制  57
        2.6.1.1.2 Bradford方法检测溶液中蛋白质的含量  57
        2.6.1.1.3 BSA标准曲线的测定  57-59
        2.6.1.1.4 糖基化聚丙烯膜对BSA吸附的测定  59
      2.6.1.2 BSA溶液的动态过滤实验  59-60
      2.6.1.3 血小板黏附实验  60-61
        2.6.1.3.1 富血小板血浆的制备  60
        2.6.1.3.2 磷酸盐缓冲溶液(PBS)的配制  60
        2.6.1.3.3 血小板黏附实验  60-61
    2.6.2 糖基化膜表面的特异性识别能力  61-64
      2.6.2.1 Con A的吸附实验  61-62
        2.6.2.1.1 磷酸盐缓冲溶液(PBS)的配制  61
        2.6.2.1.2 Con A标准曲线的测定  61-62
        2.6.2.1.3 糖基化膜对Con A吸附的测定  62
      2.6.2.2 荧光标记Con A(FL-Con A)的识别实验  62-64
        2.6.2.2.1 HEPES缓冲溶液的配制  62
        2.6.2.2.2 糖基化膜对FL-Con A的吸附  62
        2.6.2.2.3 脱吸附实验  62-64
第三章 紫外辐照引发含糖单体在聚丙烯膜上的接枝聚合  64-88
  3.1 研究目的及内容  64-65
  3.2 结果与讨论  65-87
    3.2.1 含糖单体的合成与表征  65-68
      3.2.1.1 α-烯丙基葡萄糖的合成与表征  65-66
      3.2.1.2 甲基丙烯酸-2-葡萄糖酰胺乙酯的合成与表征  66-68
    3.2.2 紫外辐照引发AG在聚丙烯微孔膜表面的接枝聚合  68-77
      3.2.2.1 紫外光辐照时间对接枝密度的影响  68-69
      3.2.2.2 单体浓度对接枝密度的影响  69-70
      3.2.2.3 BP浓度对接枝密度的影响  70
      3.2.2.4 接枝改性膜表面的结构表征与性能测定  70-77
        3.2.2.4.1 接枝改性膜表面的FT-IR/ATR分析  70-71
        3.2.2.4.2 接枝改性膜表面的XPS分析  71-74
        3.2.2.4.3 接枝改性膜表面的形貌分析  74-75
        3.2.2.4.4 膜表面水接触角测量  75-77
    3.2.3 紫外辐照引发GAMA在聚丙烯微孔膜表面的接枝聚合  77-87
      3.2.3.1 紫外光辐照时间对接枝密度的影响  77-78
      3.2.3.2 单体浓度对接枝密度的影响  78
      3.2.3.3 BP浓度对接枝密度的影响  78-79
      3.2.3.4 接枝改性膜表面的结构表征与性能测定  79-87
        3.2.3.4.1 接枝改性膜表面的FT-IR/ATR分析  79
        3.2.3.4.2 接枝改性膜表面的XPS分析  79-82
        3.2.3.4.3 接枝改性膜表面的形貌分析  82-83
        3.2.3.4.4 膜表面接触角的测量  83-87
  3.3 小结  87-88
第四章 膜表面官能单体接枝以及糖基固定化  88-110
  4.1 研究目的及内容  88
  4.2 结果与讨论  88-108
    4.2.1 甲基丙烯酸-2-氨乙酯盐酸盐官能单体法  88-98
      4.2.1.1 紫外辐照引发AEMA在聚丙烯微孔膜表面的接枝聚合  89-91
        4.2.1.1.1 紫外光辐照时间对接枝密度的影响  89
        4.2.1.1.2 单体浓度对接枝密度的影响  89-90
        4.2.1.1.3 BP浓度对接枝密度的影响  90-91
      4.2.1.2 糖基的固定  91-93
      4.2.1.3 接枝改性膜表面的结构表征与性能测定  93-98
        4.2.1.3.1 接枝改性膜表面的FT-IR/ATR分析  93-94
        4.2.1.3.2 接枝改性膜表面的XPS分析  94-96
        4.2.1.3.3 接枝改性膜的表面形态  96-97
        4.2.1.3.4 膜表面水接触角的测量  97-98
    4.2.2 丙烯酰胺官能单体法  98-108
      4.2.2.1 紫外光引发丙烯酰胺在聚丙烯微孔膜表面的接枝聚合  99-101
        4.2.2.1.1 紫外光辐照时间对接枝密度的影响  99
        4.2.2.1.2 单体浓度对接枝密度的影响  99-100
        4.2.2.1.3 BP浓度对接枝密度的影响  100-101
      4.2.2.2 膜表面聚丙烯酰胺接枝链的Hofmann重排  101-102
      4.2.2.3 糖基的固定  102
      4.2.2.4 接枝改性膜表面的结构表征与性能测定  102-108
        4.2.2.4.1 接枝改性膜表面的FT-IR/ATR分析  102-104
        4.2.2.4.2 接枝改性膜表面的XPS分析  104-107
        4.2.2.4.3 接枝改性膜表面的表面形态  107-108
        4.2.2.4.4 膜表面水接触角的测量  108
  4.3 小结  108-110
第五章 聚丙烯微孔膜表面的可控糖基化  110-131
  5.1 研究目的及内容  110
  5.2 结果与讨论  110-129
    5.2.1 聚丙烯微孔膜表面可控接枝梳状含糖聚合物  110-119
      5.2.1.1 紫外辐照引发HEMA在聚丙烯微孔膜表面的接枝聚合  111
      5.2.1.2 ATRP引发基团的固定  111-112
      5.2.1.3 聚丙烯微孔膜表面引发含糖单体的ATRP接枝聚合  112-114
        5.2.1.3.1 溶剂中水含量对聚合过程的影响  112-113
        5.2.1.3.2 溴化铜加入对聚合过程的影响  113-114
      5.2.1.4 接枝改性膜表面的结构表征  114-119
        5.2.1.4.1 接枝改性膜表面的FT-IR/ATR分析  114-115
        5.2.1.4.2 接枝改性膜表面的XPS分析  115-118
        5.2.1.4.3 接枝改性膜表面的表面形态  118-119
    5.2.2 聚丙烯微孔膜表面可控接枝线形含糖聚合物  119-129
      5.2.2.1 膜表面溴化  120
      5.2.2.2 溴化膜表面的表征  120-125
        5.2.2.2.1 溴化膜表面的红外分析  120-121
        5.2.2.2.2 溴化膜表面的XPS分析  121-123
        5.2.2.2.3 溴化膜表面的形貌分析  123-124
        5.2.2.2.4 溴化膜表面的接触角  124-125
      5.2.2.3 溴化聚丙烯微孔膜表面引发含糖单体的ATRP接枝聚合  125-126
      5.2.2.4 接枝改性膜表面的结构表征  126-129
        5.2.2.4.1 接枝改性膜表面的FT-IR/ATR分析  126
        5.2.2.4.2 接枝改性膜表面的XPS分析  126-128
        5.2.2.4.3 接枝改性膜表面的表面形态  128-129
  5.3 小结  129-131
第六章 糖基化膜表面的仿生功能  131-148
  6.1 研究目的及内容  131
  6.2 结果与讨论  131-146
    6.2.1 直链葡萄糖基化膜的抗非特异性吸附能力  131-139
      6.2.1.1 直链葡萄糖基化膜对BSA的静态吸附  131-134
        6.2.1.1.1 不同含糖聚合物接枝密度修饰膜表面对BSA的非特异性吸附  132-133
        6.2.1.1.2 不同链结构及链长含糖聚合物修饰膜表面对BSA的非特异性吸附  133-134
      6.2.1.2 直链葡萄糖基化膜的BSA溶液动态过滤实验  134-137
      6.2.1.3 直链葡萄糖基化膜表面的血小板黏附  137-139
    6.2.2 环状葡萄糖糖基化膜对蛋白质的特异性识别  139-146
      6.2.2.1 环状葡萄糖基化膜对Con A的特异性识别  139-146
        6.2.2.1.1 Con A在膜表面的特异性识别  139-140
        6.2.2.1.2 环状葡萄糖基化膜对FL-Con A的特异性识别  140-142
        6.2.2.1.3 FL-Con A的脱吸附  142-146
  6.3 小结  146-148
第七章 结论  148-152
参考文献  152-165
博士论文工作期间科研成果  165-168
致谢  168-169
作者简介  169-170

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