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再生Bombyx mori丝素蛋白在水溶液中结构和性质的研究

作　者: 杨宇红
导　师: 邵正中
学　校: 复旦大学
专　业: 高分子化学与物理
关键词: 再生丝素蛋白构象吸附动态表面张力自组装纳米颗粒
分类号: O629.73
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

蚕丝由于其优异的性能，一直以来广受世人青睐，而且蚕丝蛋白相对简单的结构使其在蛋白质研究领域中受到越来越多的关注。本文通过一系列实验手段研究了再生Bombys mori丝素蛋白在水溶液中的构象转变情况和空气—水界面上的吸附行为，同时对丝素蛋白在水溶液中的自组装行为进行了初步的探索。在本研究中，我们应用1-苯胺基萘-8-磺酸镁（ANS）作为外源探针，通过荧光猝灭技术研究水溶液中再生Bombyx mori丝素蛋白的结构及其构象转变。结果表明：（1）再生丝素蛋白中疏水核的坍塌引发了整个蛋白质结构由无规线团向β—折叠转变；（2）当再生丝素蛋白处于无序状态下，色氨酸（Trp）残基的位置是异源性的，大多数色氨酸分布在蛋白质的表面。这种色氨酸残基的不均衡分布可能是由于临近带电荷的氨基酸侧链排斥作用或者一些蛋白质片段的屏蔽作用造成的。然而，随着蛋白质的构象由无规线团结构向β—折叠结构转变，这些色氨酸的周围环境逐渐趋同；（3）在再生丝素蛋白热稳定性的研究中，对于升温和降温的循环过程，蛋白质的构象变化基本上是可逆的，说明加热时，在丝素蛋白无序的结构和β—折叠结构间存在着平衡，并且在实验范围内（0℃～100℃）丝素蛋白的热变性只是一个部分变性过程，而这种结构变化的中间点是45℃。同时在丝素蛋白的热致构象转变过程中，在约40℃～60℃的温度之间出现了丝素蛋白二级结构的中间体；（4）水的介入对蛋白质的构象转变起着至关重要的作用，它促进了分子链的运动，起着类似增塑剂的作用；（5）由于丝素蛋白含有较多带电荷的氨基酸，因此酸度对丝素蛋白的结构有着一定的影响：环境酸性越强，丝素蛋白容易发生从无规线团到β—折叠结构转变；相对而言，碱性条件则更有利于丝素蛋白以无规线团结构稳定存在。当pH在4附近时，丝素蛋白的无规结构最易发生改变；而pH为6左右时，丝素蛋白结构最稳定。这种变化趋势与成熟蚕腺体中丝素蛋白所处的环境及其状态相当吻合，证实了pH值是蚕在生物体中控制其丝素蛋白状态的一个相当重要的手段，对人工纺丝条件的控制有着极其重要的现实意义。而且在相当宽的酸度范围内，均发现了丝素蛋白二级结构中间体形态的存在，表明丝素蛋白的变性过程不符合简单的二态机制。悬滴实验技术被用于研究水—空气界面上再生Bombyx mori丝素蛋白的吸附行为。（1）作为异源生物大分子，丝素蛋白表现出很高的表面活性。其水溶液的表面张力对丝素蛋白分子量以及其在本体中的浓度极为敏感。临界胶束浓度约为2.2×10^-2g／mL；（2）在吸附的初始阶段，丝素蛋白表现为纯粹的扩散控制吸附机制。随着吸附过程的进行，整个吸附行为偏离扩散机制，变成吸附—动力学混合控制机制；（3）扩散到表面后，丝素蛋白在水—空气界面的吸附分为两个全然不同的步骤，分别可用两个first-order吸附速率常数k₁和k₂来表征，它们也具有分子量以及本体浓度依赖性。其中，第一个吸附速率常数大于第二个吸附速率常数；（3）由于丝素蛋白分子量的非均一性，小分子的丝素蛋白首先占据溶液表面，然后逐渐被大分子的丝素蛋白分子部分取代；（4）相对于低分子量的丝素蛋白分子，较大分子量（体积）的丝素蛋白分子拥有较低的分子柔韧性和较高的结构稳定性，因此也拥有较高的表面活性和较低的吸附效率；（5）由于丝素蛋白氨基酸中疏水侧链和亲水侧链的相间排列，且具有相近的比例，温度对丝素蛋白分子疏水区域和亲水区域的影响相互抵消，因此温度对丝素蛋白分子的表面活性影响不大。但是，温度能够引起本体和界面的丝素蛋白分子的构象转变，因此，对于热循环过程来说，丝素蛋白在水—空气界面的吸附是部分可逆的；（6）虽然乙醇分子具有比丝素蛋白低的表面活性，但是较小的分子体积使之拥有远高于丝素蛋白的吸附效率。同时对于乙醇—丝素蛋白混合体系，乙醇分子将先吸附到表面，然后逐渐被丝素蛋白分子取代。由于乙醇分子与丝素蛋白分子的疏水部分相互作用，降低了丝素蛋白溶液的表面压，使其溶液的表面张力增加；（7）pH值不仅对丝素蛋白的表面活性有着重要的影响，而且对它的吸附效率也影响很大。酸性条件不仅增强了丝素蛋白的表面活性，而且还提高了它的吸附效率。但是过强的酸性环境则会破坏分子链，使分子量降低，从而降低了丝素蛋白分子的表面活性。本研究中还对再生Bombyx mori丝素蛋白在水溶液中的自组装行为进行了探索。（1）由于丝素蛋白氨基酸特殊的疏水侧链和亲水侧链相间组成，以及形成晶区的高度重复的氨基酸和形成无定型区域的非重复氨基酸结构，使丝素蛋白分子在水溶液中非常容易发生自组装形成粒径在10～100nm的纳米聚集体；（2）随着时间的增加，这种纳米聚集体的直径逐渐增加，进而形成纤维状或膜状结构；（3）丝素蛋白分子在水溶液中自组装形成的聚集体主要为β-折叠结构。

全文目录

博士学位论文摘要  7-10
Abstract  10-13
第一章绪论  13-40
  1.1 丝素蛋白的研究现状  13-21
    1.1.1 蚕丝结构及化学组成  13-14
    1.1.2 丝素蛋白的氨基酸序列  14-15
    1.1.3 丝素蛋白的构象及聚集态结构  15-17
    1.1.4 蚕的腺体结构及其纺丝机理  17-19
    1.1.5 蚕丝及其丝素蛋白的性能及应用  19-21
  1.2 表面活性分子界面吸附行为的研究  21-25
    1.2.1 表面张力的测量方法  21
    1.2.2 动态吸附模型  21-23
    1.2.3 聚合物分子吸附  23
    1.2.4 蛋白质分子吸附  23-25
  1.3 蛋白质分子的自组装研究  25-28
    1.3.1 纳米材料  25
    1.3.2 分子自组装  25-26
    1.3.3 高分子聚合物的自组装  26
    1.3.4 蛋白质分子的自组装研究  26-28
  1.4 论文设计及主要内容  28-29
  参考文献  29-40
第二章再生丝素蛋白在水溶液中结构的研究  40-79
  2.1 引言  40-42
  2.2 实验部分  42-46
    2.2.1 材料与试剂  42-43
    2.2.2 丝素蛋白样品的制备  43
    2.2.3 样品表征  43-46
  2.3 实验结果与讨论  46-74
    2.3.1 丝素蛋白的圆二色谱研究  46-49
    2.3.2 丝素蛋白的荧光特征  49-53
    2.3.3 丝素蛋白中色氨酸残基的荧光猝灭性质研究  53-55
    2.3.4 丝素蛋白与外源荧光探针ANS结合作用的研究  55-57
    2.3.5 温度诱导的丝素蛋白构象转变  57-61
    2.3.6 pH值对丝素蛋白构象转变的影响  61-74
  2.4 本章小结  74-75
  参考文献  75-79
第三章再生丝素蛋白在水—空气界面上吸附机制的研究  79-116
  3.1 引言  79-80
  3.2 实验部分  80-83
    3.2.1 材料与试剂  80-81
    3.2.2 再生丝素蛋白水溶液的失重分析  81
    3.2.3 动态表面张力测试  81-83
      3.2.3.1 丝素蛋白浓度的影响  82
      3.2.3.2 分子量的影响  82-83
      3.2.3.3 温度的影响  83
      3.2.3.4 溶剂的影响  83
      3.2.3.5 pH值的影响  83
  3.3 实验数据的数学处理  83-85
    3.3.1 WARD-TORDAI方程  83-84
    3.3.2 FIRST-ORDER速率方程  84-85
    3.3.3 对实验数据的拟合  85
  3.4 实验结果和讨论  85-111
    3.4.1 再生丝素蛋白水溶液的失重分析  85-86
    3.4.2 丝素蛋白水溶液的动态表面张力研究  86-111
      3.4.2.1 本体浓度对丝素蛋白在水—空气界面上吸附行为的影响  86-91
      3.4.2.2 实验结果的动力学分析  91-94
      3.4.2.3 丝素蛋白分子量对溶液动态表面张力的影响  94-99
      3.4.2.4 温度对丝素蛋白溶液动态表面张力的影响  99-104
      3.4.2.5 溶剂对丝素蛋白表面吸附行为的影响  104-107
      3.4.2.6 pH对丝素蛋白对丝素蛋白表面吸附行为的影响  107-111
  3.5 本章小结  111-112
  参考文献  112-116
第四章再生丝素蛋白分子在水溶液中自组装行为的初步研究  116-131
  4.1 引言  116-117
  4.2 实验部分  117-118
    4.2.1 样品制备  117
    4.2.2 样品的表征  117-118
      4.2.2.1 扫描电子显微镜(SEM)观察  117-118
      4.2.2.2 原子力显微镜(AFM)观察  118
      4.2.2.3 拉曼(Raman)光谱测试  118
  4.3 实验结果与讨论  118-127
    4.3.1 再生丝素蛋白的自组装行为扫描电镜(SEM)研究  119-120
    4.3.2 再生丝素蛋白的自组装行为原子力显微镜研究  120-124
    4.3.3 再生丝素蛋白的自组装行为的RAMAN光谱分析  124-126
    4.3.4 再生丝素蛋白的自组装行为的机理讨论  126-127
  4.4 本章小结  127-128
  参考文献  128-131
第五章博士论文工作总结  131-134
致谢  134-135
附录  135-145
  附录一家蚕丝素蛋白氨基酸序列  135-140
  附录二家蚕丝素蛋白重链氨基酸的有序排列  140-143
  附录三一些关于丝素蛋白重链的参数  143-144
  附录四 Main Raman band wavenumbers and assignments for silk fibroin film,liquid silk,Silk Ⅰ-Cp and Silk Ⅱ-cp~2  144-145

再生Bombyx mori丝素蛋白在水溶液中结构和性质的研究

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