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人红细胞膜上Protein 4.2与其它蛋白质的相互作用研究

作　者: 苏旸
导　师: 张志鸿
学　校: 复旦大学
专　业: 生物物理学
关键词: 蛋白相互作用复旦大学人红细胞膜博士学位论文氨基酸残基重组蛋白突变蛋白蛋白质相互作用相互作用模式细胞骨架
分类号: Q26
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

Protein 4.2(P4.2或band 4.2)是人红细胞膜上重要的周围膜蛋白，在每个红细胞上约有200，000个拷贝，约占红细胞膜上蛋白质总量的5％。P4.2基因位于人第15号染色体的q15区段，长度大约为20Kb，含有的13个外显子编码了691个氨基酸，其理论分子量为76，841Da。P4.2能够与带3蛋白(band 3)，ankyrin以及spectrin直接相互作用，P4.2还能与Protein 4.1，CD47等结合，将Rh复合体结合到红细胞的细胞骨架网络中。Band 3是人红细胞膜上最重要的蛋白质之一，它的胞质段(cdb3)与细胞骨架蛋白ankyrin、protein 4.1和protein 4.2等相互作用，调控细胞膜和细胞骨架之间相互作用；Ankyrin通过与band 3及spectrin的作用，将细胞骨架固定在脂膜双分子层上。P4.2的重要性日益受到关注，因为研究表明P4.2的缺失可以导致明显的红血球溶血、贫血症以及各种的遗传性球形红细胞症和遗传性椭球形红细胞增多症。遗传性球形红细胞增多症(hereditary spherocytosis，HS)的主要症状是球形红细胞增多，这些球形红细胞相对于双凹型红细胞而言，其渗透性增强，在机械力作用下更容易破碎，最终导致溶血性的贫血。HS主要和红细胞膜上的带3蛋白、protein 4.2、spectrin和ankyrin的异常有关。人红细胞的形状维持和可变性是由蛋白质—蛋白质相互作用和蛋白质—脂质相三者之间的相互作用模式共同实现的，在红细胞中，细胞膜骨架包含有两个方向上面的相互作用方式，垂直方向的band 3-ankyrin-spectrin相互作用和水平方向的spectrin-protein 4.1-actin相互作用。P4.2也参与细胞膜骨架的相互作用，但是它的确切功能未知。作为红细胞膜上最晚被表达的蛋白质之一，我们对它的了解很少，它是如何行使生理功能?它与膜上最重要的蛋白质band 3和ankyrin发生相互作用，这三者之间的相互作用模式又是如何的?为了研究P4.2的确切生理功能以及与band 3、ankyrin三者之间的相互作用模式，我们首先建立了可靠的in vitro实验系统。我们尝试通过分子生物学的方法，从人肝cDNA中克隆了P4.2的全长序列，并在大肠杆菌中大量表达重组的P4.2蛋白，但发觉全长P4.2蛋白的表达不佳，这可能与P4.2包含有一个疏水性较强的区段有关。通过葡萄球菌V8蛋白酶和溴化氰对P4.2蛋白的限制性酶切分析，我们选取了一系列序列重叠的P4.2片段进行克隆表达。我们成功地表达了8种含有不同融合接头的重组P4.2片段蛋白：GST-P4.2(31-200)、GST-P4.2(187-260)、GST-P4.2(155-211)、GST-P4.2(155-260)、GST-P4.2(34-185)、GST-P4.2(100-211)、GST-P4.2(100-260)和Trx-P4.2(1-300)。我们还克隆表达了GST-cdb3、His6-cdb3、GST-ankyrinD34和Trx-ankyrinD34这四种重组蛋白。经过优化表达条件，并通过离子交换层析、亲和层析和分子筛纯化，我们得到了较纯的各种重组蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot，验证了各种重组蛋白。随后通过Far-Western blot和Pull-down assay实验，我们发现P4.2的第31-200位氨基酸片段是与ankyrin可能的直接相互作用区段，而且很可能是在第187-200位氨基酸区段；P4.2与cdb3的相互作用区段精确到第201-211位氨基酸。由于目前为止共有9种P4.2基因突变可以导致遗传性球形红细胞增多症，其中4种错义突变特别引起了我们的注意。通过对比P4.2的三维结构模拟图，发现发生突变的第175位氨基酸残基恰好位于连接P4.2的两个结构域domain1和domain2的区段上，所以我们预测第175位氨基酸残基的突变可能导致P4.2不能与ankyrin结合。于是我们采用了点突变的方法，克隆表达了4种重组的突变蛋白GST-P4.2(31-200)D175Y、GST-P4.2(31-200)D175Y、GST-P4.2(100-260)D175Y，GST-P4.2(31-200)A142T，发现第175位氨基酸残基的突变使得相应的重组蛋白均不能与ankyrin直接相互作用，而第142位氨基酸残基的突变对P4.2与ankyrin之间的相互作用没有影响，这说明第175位氨基酸对于P4.2与ankyrin的结合是非常重要的，很可能是一个关键位点。为了进一步研究第175氨基酸残基突变对相互作用产生影响的模式，我们根据第175位氨基酸由D(Asp)突变为Y(Tyr)，设计了相应的3种氨基酸残基突变，分别是D(Asp)突变为K(Lys)、F(Phe)和A(Ala)。通过Far-Western blot和Pull-down assay，我们发现GST-P4.2(31-200)D175K能够与ankyrin直接相互作用，而其它两种突变蛋白GST-P4.2(31-200)D175F和GST-P4.2(31-200)D175A均不能与ankyrin直接结合。因此，我们认为，在Protein 4.2 Komatsu中，第175位氨基酸残基由带负电荷的天冬氨酸突变为非极性的带芳香环的酪氨酸，由于电荷效应的改变引起了P4.2蛋白的domain1和domain2之间的空间结构发生变化，导致了P4.2与ankyrin之间不能结合，破坏了ankyrin-P4.2-band 3三者之间的相互作用，使得膜骨架结构不能很好地被提呈到膜上，或者说导致膜骨架结构的稳定性下降，从而不能继续维持红细胞的双凹圆盘形状，红细胞变为球形。其渗透性增强，在机械力作用下更容易破碎，最终导致溶血性的贫血。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
常用缩写  8-9
第一部分综述  9-36
  第一节人红细胞膜概述  9-25
  第二节人红细胞膜P4.2蛋白的研究进展  25-36
第二部分引言  36-38
第三部分材料和方法  38-52
  第一节材料、试剂、基本操作和仪器设备  38-42
  第二节实验方法和步骤  42-52
第四部分结果与讨论  52-93
  一、从人红细胞膜中提纯P4.2蛋白  52-54
  二、尝试在不同载体中克隆、表达全长P4.2蛋白  54-55
  三、尝试在不同载体中克隆、表达一系列P4.2片段蛋白  55-57
  四、重组蛋白表达条件的优化  57-59
  五、重组蛋白纯化条件的优化  59-63
  六、重组蛋白的复性  63-65
  七、Western blot检测表达的P4.2蛋白各片段  65
  八、Cdb3和ankyrin D34的表达纯化  65-67
  九、鼠多抗的制备与纯化  67-70
  十、Far-Western assay研究P4.2与ankyrin,cdb3之间的相互作用  70-72
  十一、Pull-down assay研究P4.2与ankyrin、cdb3之间的相互作用  72-78
  十二、突变蛋白的克隆表达纯化  78-84
  十三、突变蛋白与ankyrin之间的相互作用研究  84-90
  十四、突变蛋白与ankyrin、cdb3之间的相互作用研究  90-93
第五部分总结和展望  93-97
参考文献  97-115
论文发表情况  115-116
附录  116-120
  附录一 Protein 4.2氨基酸序列  116-117
  附录二 PGEX-4T质粒载体信息  117-118
  附录三 pET32a质粒载体信息  118-119
  附录四 PT7 473质粒载体信息  119-120
致谢  120-121

人红细胞膜上Protein 4.2与其它蛋白质的相互作用研究

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