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TTV感染、致病性、基因变异和新型肝炎病毒研究方法的探索

作　者: 姬新颖
导　师: 杨为松；王海涛
学　校: 第四军医大学
专　业: 内科学
关键词: 新型肝炎病毒 TTV PCR 致病性原位杂交代表性差异分析减数抑制杂交 cDNA文库非甲非庚型肝炎
分类号: R512.6
类　型: 博士论文
年　份: 1999年
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内容摘要

不明原因的肝炎——非甲非戊型肝炎在临床肝炎病例中占有一定的比例，庚型肝炎病毒(HGV)的发现，使未知肝炎的研究又向前迈了一步。但非甲非戊型肝炎中HGV感染的比例仅为10％，说明HGV不是未知肝炎的主要病因，还存在有其它的致病因子。1997年初，我们用非甲非庚型肝炎病人的血清感染猕猴，结果有几只猴子的血清转氨酶持续升高，表明动物有感染，血清中有未知感染因子。1997年底日本发现了TTV，与我们的动物试验结果相吻合。为了解中国不同地区不同人群TTV感染率，我们从新疆、西藏、广西、山东等地区采集血样，根据日本发表的TTV序列设计引物，进行PCR检测，并对部分地区的TTV进行了序列测定；同时，为了解TTV是否有肝脏致病性，我们对从郑州收集来的石蜡包埋肝病理组织进行PCR检测和原位杂交分析。现将结果报告如下。 1 二种TTV DNA模板提取方法的建立和比较用二种方法对97份广西肝癌病人的血清TTV-DNA进行提取；用自行设计的引物进行PCR检测，并对5’和3’端非编码区(NCR)的PCR产物进行克隆测序，以确认摸板提取方法、引物和PCR的可靠性。结果为，用玻璃粉法提取模板的PCR阳性率为16.5％(17／97)，而STG法阳性率仅为4.1％(4／97)。二者之间有显著的差异(P＜0.001)。差异的主要原因是因为二者起始血清的量不同，玻璃粉法为150ul，而STG法仅为50ul。将STG法的血清量改为100ul后取得了稳定的结果。二种方法有不同的适用范围——当标本血清量很少时可用STG法提取摸板；而玻璃粉法提取核酸特别适合于大量样品的筛查，因为其价格低廉、易于推广普及。将5’和3’NCR序列通过Internet利用美国国立医学图书馆提供的网上序列分析软件BLAST与基因库(GenBank)中的序列进行比较、对排，证实我们所测的为TTV序列，与日本株TTV序列的同源性为88％。同时，说明用STG法提取的TTV DNA、设计的引物和所用的PCR系统可以有效地用于检测TTV，为今后利用PCR研究TTV的致病性等提供了条件。 2 部分地区不同人群TTV感染情况及序列变异的分析 ①用聚合酶链式反应(PCR)对不同地区的170份血清进行了TTV-DNA检测。结果显示，TTV的平均感染率为30.6％，不同人群和肝病病人中存在

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英文缩略语  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-11
前言  11-12
文献回顾  12-19
主要仪器  19-20
主要试剂  20-21
课题设计  21-24
通用实验方法  24-28
课题研究报告  28-67
  (一) 新型肝炎病毒TTV感染、致病性和基因变异的研究  28-53
    1 血清TTV DNA二种提取方法的比较  29-37
    2 部分地区不同人群血清TTV感染的调查分析  37-41
    3 用PCR法从石蜡包埋肝组织中检测TTV  41-46
    4 用原位杂交法从石蜡包埋肝组织中检测TTV  46-50
    5 TTV部分序列变异的研究  50-53
  (二) 附：寻找新型肝炎病毒基因方法的初步探索(概要)  53-67
    Ⅰ HGV和HCV cDNA组合文库的建立与鉴定  54-57
    Ⅱ 用减数抑制杂交法寻找新肝炎病毒基因  57-64
    Ⅲ 用代表性差异分析法寻找新肝炎病毒基因  64-67
结论  67-68
参考文献  68-73
附-1：综述  73-89
  1 基因疫苗的特点、应用和最新进展  73-81
  2 Internet与生物信息学  81-89
附-2：个人简历  89-92
致谢  92

TTV感染、致病性、基因变异和新型肝炎病毒研究方法的探索

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