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大鼠精子发生阶段特异表达基因的分离和表达

作　者: 刘辉贤
导　师: 王琳芳；缪时英；张梅林
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 生物化学
关键词: 精子发生减数分裂曲细精管精母细胞生精细胞博士学位论文转录本磷酸化位点医科大学反转录
分类号: Q344
类　型: 博士论文
年　份: 1999年
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内容摘要

精子发生是一系列基因严格按照时空顺序相继转录表达的过程。寻找和研究不同时期、不同发育阶段的差异表达基因，将有助于最终阐明精子发生的机理。由于大鼠生精细胞在曲细精管内的排列极为有序，本研究采用曲细精管分段分离结合差异显示PCR（DDRT-PCR）的方法，寻找精子发生中差异表达的基因。在解剖显微镜下根据折光度不同将曲细精管分出Ⅱ～Ⅵ期和Ⅶ～Ⅷ期两段，Ⅱ～Ⅵ期中包含精原细胞分裂产生A、B两型精原细胞、变形期初级精母细胞向粗线期精母细胞的转化和2～6级以及15～18级精细胞，Ⅶ～Ⅷ期中包含A型精原细胞、休止型精母细胞、粗线期精母细胞、7～8级和19级精细胞以及成熟精子的释放，Ⅶ～Ⅷ期中不含细胞分裂。提取两段的组织总RNA并反转录成cDNA，以3个Oligo-dT₁₂N（N为A、C、G）单锚定引物分别与上游8个随机引物进行24种配对组合，共48个扩增反应，经聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影后选出112个差异cDNA条带，再经反向Northern斑点杂交验证，有76个cDNA条带代表的基因在不同区段中存在差异转录，其中17个差异达10倍以上。对36个有差异的cDNA条带进行克隆测序，得到22个彼GenBank接收的新的Expression Sequence Tags（ESTs），其中来自Ⅱ～Ⅵ期的有14个（AF094604、AF094605、AF094606、AF094607、AF095318、AF095320、AF095321、AF095322、AF095324、AF095325、AF096087、AF096088、AF096089、AF134584、），来自Ⅶ～Ⅷ期的有8个（AF095319、AF095323、AF096090、AF133655、AF133656、AF133287、AF133288、AF133289）。在此基础上，选择6个ESTs作为混合探针筛选大鼠睾丸cDNA文库，得到一新的全长2183bp、编码526个氨基酸的cDNA序列（GenBank接收号为AF094609），命名为R337，其编码蛋白的预测分子量为60000，等电点为4.0，经蛋白数据库分析发现其氨基酸序列存在一个P34cdc2的磷酸化位点、一个蛋白激酶A（PKA）磷酸化位点、多个蛋白激酶C（PKC）和酪蛋白激酶Ⅱ（CK-Ⅱ）的磷酸化位点以及多个DNA结合Motif。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-10
前言  10-15
材料方法  15-51
实验结果  51-85
实验讨论  85-98
文献综述  98-124
小结  124-146
致谢  146

大鼠精子发生阶段特异表达基因的分离和表达

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