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猪内源性反转录病毒的相关研究

作　者: 吕茂民
导　师: 章金刚；丁壮
学　校: 中国人民解放军军需大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪内源性反转录病毒检测中华实验小型猪存在与表达囊膜基因克隆转染 G418抗性 HEK293细胞细胞模型感染
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

猪作为实验动物已经在胚胎学、肿瘤学、免疫学以及人类多种疾病的研究中得到了广泛的应用。由于猪的心血管系统、消化系统、皮肤系统等与人类具有较大的相似性，一直是人类异种器官移植的首选供体，并且猪→人异种移植的研究也取得了令人鼓舞的进展。 1997年，Pateince等首次发现猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)在体外可以感染人的多种细胞，这一发现引起了人们对异种移植安全性的广泛关注，人们担心带有PERV的猪源细胞或器官一旦植入高度免疫抑制的人体内会否突破种间屏障造成人源大流行。因此，猪内源性病毒的研究与检测是猪→人异种器官移植、人用猪源生物制品等生物安全性的基础，也是进行高等级医学实验的前提。我国已经开展了猪→人异种器官移植的相关项目，但PERV的研究尚属空白。为了开发利用我国小型猪猪种资源并为实验用猪的病原安全性提供可靠的评价，我们开展了PERV的相关研究工作。我们结合国内开展的相关科研项目进行了PERV的前期研究工作，现分述如下： 1．PERV特异性检测方法的建立及对猪源传代细胞系的检测。根据已发表的PERV相关序列，合成了6对引物，应用PCR的方法对4株猪源细胞DNA样品及COS-7细胞DNA对照样品进行检测并对反应条件进行了优化，结果表明此方法能特异性地检测出PERV前病毒的存在情况：应用RT-PCR的方法对5种细胞的RNA样品进行检测PERV表达情况，结果显示所建立的RT-PCR方法也是特异的。PERV特异性检测方法的建立为我们后面的研究工作打下了基础。 2．中华实验小型猪中内源性反转录病毒的存在与表达。应用PCR和RT-PCR的方法，对来源于中华实验小型猪外周血淋巴细胞(PBL)的DNA和RNA样品进行了系统的检测。结果表明，在所有被检样品中均有PERV前病毒的存在，且存在于基因组中的前病毒均能以mRNA的形式进行表达。由于囊膜基回具有一定的变异性，根据env基因的不同通常将PERV分为三种个问的亚到，即 PERV－A、PERV－B和 PERV－C。应用分型引物对被检样品进行了分型检测，结果显示在所有的样品中均有A和B亚型的存在与表达，只有两例检出了C亚型前病毒的存在；所有样品中均未检出PERV（的表达。本研究对我国特有小型猪的实验动物化具有重要意义。 3．中华实验小型猪来源的PERV囊膜基因的克隆与同源序列比较。应用RT．PCR 的方法从中华实验小型猪外周血淋巴细胞RNA样品中钓取了PERVenv基因，并克隆至pGEM＊载体。序列测定表明，所克隆的env基因含有2004个核着酸。经序列分析证实，该片段含有一个完整的读码框架，长为1983hp，编码660个氨基酸，为PE RVRV－A亚型。同源序列比较．显小，该基因与法系大白猪来源的P＊RV叭1的囊膜基因具有97％的序列同源。他与欧洲小型猪来源的PERV囊膜基因具有82％的序列同源性。序列测定的结果为进一步从分于水平研究PERV奠定了基础。 4．猪内源性反转录病毒感染人HEK293细胞模型的建立。为了证实PERV对人源细胞的感染，首先，将含有neo基因的质粒pIRESneo通过脂质体转染了 293细胞，并培育了 G418抗性的 HEK293细胞。然后应用 PK15和 G418抗。叮293细胞共培养、经G418加压筛选的方法成功地建立了PERV感染HEK293细胞的模型。这一感染模型的成功建立，为今后的研究工作提供了一个极好的实验平台，也有利于对PERV的病原安全性作进一步的评价。综上所述，本课题的研究工作己具有了良好基础，为进一步深入研究PERV创造了条件，也为进行PERV安全性评价提供了依据。

全文目录

英文缩略词表  6-7
中文摘要  7-9
文献综述猪内源性反转录病毒与异种移植的安全性  9-16
前言  16-19
研究内容  19-59
  实验一：猪内源性反转录病毒检测方法的建立及对四种猪源传代细胞系的检测  19-29
    材料与方法  20-23
    结果  23-26
    讨论  26-29
  实验二：猪内源性反转录病毒在中华实验小型猪中的存在与表达  29-37
    材料与方法  30-31
    结果  31-34
    讨论  34-37
  实验三：猪内源性反转录病毒囊膜基因的克隆与同源序列比较  37-47
    材料与方法  38-40
    结果  40-44
    讨论  44-47
  实验四：猪内源性反转录病毒感染 HEK293细胞模型的建立  47-59
    材料与方法  48-51
    结果  51-55
    讨论  55-59
结论  59-60
致谢  60-61
英文摘要  61-64
附录  64-65

猪内源性反转录病毒的相关研究

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