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有机介质体系单宁酶生物合成棓酸酯键的研究

作　者: 喻晓蔚
导　师: 李永泉
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 单宁酶 微胶囊固定化 微生物细胞催化 棓酸酯键 有机介质体系 生物合成 反应动力学模型 巴斯德毕赤酵母外源蛋白表达系统
分类号: Q814
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


单宁酶（tannin acyl hydrolase,EC 3.1.1.20）能够专一性水解桔酸酯键,但其市场价格昂贵、使用寿命较短,将其固定化能够提高酶的稳定性以及重复使用率。桔酸烷基酯是一类优良安全的天然抗氧化剂,具有预防心脑血管疾病、清除体内自由基、提高免疫力等功效,其中桔酸丙酯作为食品抗氧化剂的商品名叫“通脉酯”。传统工业上,桔酸烷基酯的合成通常用浓硫酸作催化剂,能耗大、污染环境、制备时间长、副反应产物多,且严重腐蚀设备;而生物合成法具有反应条件温和、环境友好、副反应少等诸多优点,具有很好的应用前景。目前有关有机介质体系中生物合成棓酸烷基酯的规律还未有深入研究,且直接利用微生物细胞合成棓酸烷基酯的研究在国内外未见报道。本文对有机介质体系中生物合成棓酸烷基酯键的规律进行了深入的研究,以游离单宁酶、固定化单宁酶、游离黑曲霉菌丝和固定化黑曲霉菌丝为催化剂载体,考察了有机介质体系的各种影响因素,并构建了有机介质体系中黑曲霉菌丝合成棓酸丙酯的反应动力学模型。同时构建了巴斯德毕赤酵母基因工程菌进行胞内表达和分泌表达单宁酶,得到较高单宁酶活力的菌种并直接应用于生物合成棓酸烷基酯。 一、首先构建了海藻酸钙微胶囊固定化单宁酶的方法,并研究比较了固定化酶和游离酶的酶学性质。结果表明海藻酸钙固定化单宁酶以及游离单宁酶的最适pH和最适反应温度分别为6.0和40℃、5.0和30℃;固定化酶的温度稳定性和pH稳定性均有提高,经过15个循环的反应相对活力只下降了10%,说明海藻酸钙固定化单宁酶能够有效提高稳定性和重复利用率。同时构建了海藻酸钙—壳聚糖固定化单宁酶,其在有机介质体系中合成棓酸丙酯的合成率为34.59%,比游离酶高19.2%。考察了水和有机溶剂对棓酸丙酯合成的影响,反应达到平衡后加入除水剂分子筛能够有效促进平衡向酯化方向移动,合成率提高了10%;在极性较强或疏水性较强的有机溶剂中合成率较低,在中等疏水性的有机溶剂苯和正己烷中合成率较高,分别为44.3%和35.7%。 二、固定化黑曲霉菌丝和游离黑曲霉菌丝有机介质体系中合成棓酸丙酯的规律研究表明,两者均在有机溶剂苯中活力较高,合成率相近分别为26.8%和25.9%,然而固定化菌丝达到反应平衡的时间比游离菌丝长48h,可见游离菌丝作为单宁酶的优良天然载体,其综合催化性能优于固定化菌丝,因此利用游离菌丝进行进一步的研究。考察了菌丝制备方式、有机溶剂、菌丝量、水活度、底物浓度、扩散限制、温度等对黑曲霉菌丝合成棓酸丙酯的影响,结果显示真空干燥处理的菌丝在pH 3.6、水含量71.4%左右时能保持较高的活力;在由10ml苯、0.35g菌丝、5.56 mmol L-1棓酸、7.3%（V/V）正丙醇、0.5%（W/V）聚乙二醇10000组成的

全文目录


第一章 绪论  12-36
  1.1 研究目的与意义  12-15
  1.2 非水相生物催化  15-26
    1.2.1 非水相生物催化概述  15-17
    1.2.2 非水相生物催化的反应介质体系  17-21
    1.2.3 有机溶剂对有机介质体系生物催化的影响  21-24
      1.2.3.1 有机溶剂对酶活性的影响  21-22
      1.2.3.2 有机溶剂对酶稳定性的影响  22-23
      1.2.3.3 有机溶剂对酶促反应选择性的影响  23-24
    1.2.4 水对有机介质体系生物催化的影响  24-25
    1.2.5 酸碱度对有机介质体系生物催化的影响  25-26
  1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展  26-29
    1.3.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的特点  26-27
    1.3.2 巴斯德毕赤酵母表达的宿主菌  27
    1.3.3 巴斯德毕赤酵母表达载体  27-28
    1.3.4 影响外源蛋白表达的主要因素  28-29
    1.3.5 巴斯德毕赤酵母表达系统的应用前景  29
  1.4 研究内容  29-30
  参考文献  30-36
第二章 海藻酸钙固定化单宁酶性质研究  36-49
  2.1 引言  36-37
  2.2 材料与方法  37-40
    2.2.1 材料  37-38
      2.2.1.1 酶  37
      2.2.1.2 主要试剂  37-38
      2.2.1.3 主要仪器  38
    2.2.2 方法  38-40
      2.2.2.1 单宁酶活力测定方法  38-39
      2.2.2.2 海藻酸钙固定化单宁酶的方法  39
      2.2.2.3 海藻酸钙固定化酶与游离单宁酶的性质测定方法  39-40
  2.3 结果与讨论  40-46
    2.3.1 单宁酶活力测定的标准曲线  40-41
    2.3.2 海藻酸钙固定化方法对单宁酶活力的影响  41-42
    2.3.3 海藻酸钙固定化酶与游离单宁酶的动力学性质比较  42-46
      2.3.3.1 最适反应pH值和pH稳定性  42-43
      2.3.3.2 最适反应温度和温度稳定性  43-44
      2.3.3.3 固定化单宁酶重复利用率的考察  44-45
      2.3.3.4 单宁酶催化单宁酸水解反应动力学  45-46
  2.4 小结  46
  参考文献  46-49
第三章 有机介质体系中海藻酸钙—壳聚糖固定化单宁酶生物合成棓酸烷基酯的研究  49-63
  3.1 引言  49-50
  3.2 材料与方法  50-52
    3.2.1 材料  50
      3.2.1.1 酶  50
      3.2.1.2 主要试剂  50
      3.2.1.3 主要仪器  50
    3.2.2 方法  50-52
      3.2.2.1 海藻酸钙—壳聚糖固定化单宁酶的方法  50-51
      3.2.2.2 固定化酶包埋率的测定  51
      3.2.2.3 HPLC法检测棓酸和棓酸丙酯  51-52
      3.2.2.4 有机溶剂与烷醇的脱水  52
      3.2.2.5 棓酸与棓酸丙酯的溶解度测定方法  52
      3.2.2.6 海藻酸钙—壳聚糖固定化酶合成棓酸丙酯的有机介质体系  52
      3.2.2.7 海藻酸钙—壳聚糖固定化酶对烷醇的选择性  52
  3.3 结果与讨论  52-60
    3.3.1 HPLC法测定的标准曲线  52-54
    3.3.2 海藻酸钙—壳聚糖固定化单宁酶方法的优化  54-56
    3.3.3 棓酸与棓酸丙酯的溶解度  56-57
    3.3.4 固定化单宁酶有机介质体系中合成棓酸丙酯  57-59
      3.3.4.1 反应时程曲线  57
      3.3.4.2 水的影响  57-58
      3.3.4.3 有机溶剂的影响  58-59
    3.3.5 海藻酸钙—壳聚糖固定化酶对烷醇的选择性  59-60
  3.4 小结  60-61
  参考文献  61-63
第四章 有机介质体系中黑曲霉菌丝生物合成桔酸烷基酯的研究  63-81
  4.1 引言  63
  4.2 材料与方法  63-65
    4.2.1 材料  63-64
      4.2.1.1 菌种  63
      4.2.1.2 培养基  63-64
      4.2.1.3 主要试剂和仪器  64
    4.2.2 方法  64-65
      4.2.2.1 黑曲霉摇瓶培养方法  64
      4.2.2.2 黑曲霉菌丝固定化方法  64
      4.2.2.3 黑曲霉菌丝pH的调节  64
      4.2.2.4 黑曲霉菌丝含水量的调节  64-65
      4.2.2.5 黑曲霉菌丝合成棓酸丙酯的有机介质体系  65
      4.2.2.6 黑曲霉L21对烷醇的选择性  65
      4.2.2.7 HPLC测定法  65
  4.3 结果与讨论  65-78
    4.3.1 有机溶剂的影响  65-67
    4.3.2 反应时程曲线  67
    4.3.3 黑曲霉菌丝浓度的影响  67-68
    4.3.4 外扩散的影响  68
    4.3.5 水的影响  68-70
      4.3.5.1 黑曲霉菌丝水含量  68-69
      4.3.5.2 体系水活度  69-70
    4.3.6 酸碱度的影响  70-71
    4.3.7 温度的影响  71-72
    4.3.8 底物浓度的影响  72-74
    4.3.9 分批加入底物棓酸的影响  74
    4.3.10 黑曲霉菌丝重复利用率的考察  74-75
    4.3.11 添加剂的影响  75-76
      4.3.11.1 除水剂  75
      4.3.11.2 辅助剂  75-76
      4.3.11.3 离子强度  76
    4.3.12 黑曲霉L21对烷醇的选择性  76-78
  4.4 小结  78-79
  参考文献  79-81
第五章 黑曲霉菌丝生物合成棓酸丙酯的热力学和反应动力学  81-98
  5.1 引言  81
  5.2 材料与方法  81
  5.3 结果与讨论  81-95
    5.3.1 温度对单宁酶活力的影响  81-83
    5.3.2 温度对单宁酶稳定性的影响  83-85
    5.3.3 单宁酶失活动力学  85-86
    5.3.4 黑曲霉菌丝生物合成棓酸丙酯的反应动力学  86-95
      5.3.4.1 双底物酶促反应的三种基本反应动力学模型  86-87
      5.3.4.2 反应动力学模型推导  87-92
      5.3.4.3 表观动力学参数的求解  92-94
      5.3.4.4 酯化反应过程的模拟  94-95
  5.4 小结  95-96
  参考文献  96-98
第六章 单宁酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达  98-125
  6.1 引言  98-100
  6.2 材料与方法  100-111
    6.2.1 菌种与质粒  100
    6.2.2 酶  100
    6.2.3 试剂盒  100
    6.2.4 其他试剂  100-101
    6.2.5 常用溶液及缓冲液  101-102
    6.2.6 培养基  102-103
    6.2.7 主要仪器  103
    6.2.8 实验方法  103-111
      6.2.8.1 米曲霉培养方法  103-104
      6.2.8.2 米曲霉基因组DNA提取  104
      6.2.8.3 单宁酶基因的克隆  104
      6.2.8.4 PCR产物的回收  104-105
      6.2.8.5 pUCm-Tan9k和pUCm-Tan3.5k质粒的构建与鉴定  105-106
      6.2.8.6 pPIC9k-Tan和pPIC3.5k-Tan表达质粒的构建与鉴定  106
      6.2.8.7 基因重组巴斯德毕赤酵母表达体系的构建  106-110
      6.2.8.8 巴斯德毕赤酵母表达单宁酶的分析  110
      6.2.8.9 巴斯德毕赤酵母有机介质体系中生物合成桔酸丙酯  110
      6.2.8.10 棓酸丙酯测定方法  110-111
  6.3 结果  111-121
    6.3.1 米曲霉单宁酶基因的克隆  111-112
    6.3.2 pUCm-Tan9k和pUCm-Tan3.5k质粒的构建  112-115
    6.3.3 pPIC9k-Tan和pPIC3.5k-Tan表达质粒的构建与鉴定  115-116
    6.3.4 单宁酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达  116-121
      6.3.4.1 G418抗性筛选高拷贝基因重组巴斯德毕赤酵母  116
      6.3.4.2 高拷贝基因重组巴斯德毕赤酵母PCR筛选  116-117
      6.3.4.3 巴斯德毕赤酵母转化表型的鉴定  117
      6.3.4.4 巴斯德毕赤酵母表达单宁酶  117-120
      6.3.4.5 巴斯德毕赤酵母有机介质体系中生物合成桔酸丙酯  120-121
  6.4 讨论  121-123
  6.5 小结  123-124
  参考文献  124-125
结论与展望  125-128
附录  128-132
攻读博士学位期间发表的论文及成果  132-134
致谢  134

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 酶工程
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