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半合成法构建GPx模拟酶

作　者: 毛世忠
导　师: 沈家骢；刘俊秋
学　校: 吉林大学
专　业: 高分子化学与物理
关键词: 催化效率模拟酶酶学抗氧化底物选择性人工酶蛋白质超氧化物歧化酶过氧化氢酶硒代半胱氨酸
分类号: O629.8
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

机体抗氧化防御体系包括酶学和非酶学机制。酶学机制包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等。大量的证据表明GPx在清除氢过氧化物的能力强于CAT。分子生物学和遗传学的证据都表明许多疾病的发生、发展都和活性氧(ROS)有关,如白内障、克山病、心脑血管疾病和衰老等,并且在发病过程中GPx的活力都不同程度的下降。因此GPx作为抗氧化药物前体有着广阔的应用前景。硒代半胱氨酸(Sec)是GPx催化必需基团,被认为是第二十一种氨基酸,它以UGA为对应密码子。Sec掺入蛋白质的机制目前还不十分清楚。实现生物硒蛋白的原核表达尚有困难,这限制了GPx的生物医学应用。因此我们应用化学和生物学技术模拟GPx的酶学行为。模拟GPx不仅能阐明酶的机理,而且具有实际应用价值。如何产生高催化效率的GPx人工酶,对化学家和生物学家是一个长期的挑战。我们从GPx的结构出发,利用化学和生物学的方法和原理,制备出新颖的高活力的GPx人工酶。 1.GSH含硒印迹蛋白质模拟GPx 设计并改造天然存在的酶对阐明酶催化反应机理和产生工业用途的酶非常重要。因为通过异源表达产生含硒蛋白质极其困难,因此如何产生具有高催化效率和底物选择性的半合成含硒酶对科学家是巨大的挑战。为了获得高催化效率和高底物选择性的半合成含硒酶,我们选用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin Carlsberg)为蛋白骨架,通过化学修饰转换为硒化枯草杆菌蛋白酶,然后对其活性部位进行改造制备出具有GSH结合部位的含硒印迹酶。我们的策略不同于以前的生物印迹的方法,我们用共价键(Se-s键)连接模版分

全文目录

第一章文献综述  16-74
  1.1 半合成法  16-40
    1.1.1 化学修饰调节酶的活性及底物特异性  16-29
      1.1.1.1 天然酶催化基团的化学修饰  16-19
      1.1.1.2 天然酶重组片断的化学修饰  19-23
      1.1.1.3 天然酶的底物特异性的调节  23-26
      1.1.1.4 蛋白质与辅助因子的共价连接  26-29
    1.1.2 引入新的酶活性到蛋白质和酶  29-40
      1.1.2.1 含金属离子体系  29-32
        1.1.2.1.1 含有邻二氮杂菲的构建  29-31
        1.1.2.1.2 以EDTA为基础的构建  31-32
      1.1.2.2 不含金属离子的构建  32-39
        1.1.2.2.1 转氨酶  32-35
        1.1.2.2.2 黄素酶  35-37
        1.1.2.2.3 含硒体系  37-39
      1.1.2.3 生物印迹酶  39-40
  1.2 谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)  40-45
    1.2.1 GPx的结构  41-44
    1.2.2 GPx的催化机制  44-45
  1.3 GPx的人工模拟  45-59
    1.3.1 有机硒化合物模拟GPx  45-54
      1.3.1.1 硒的氧化还原特性  45-47
      1.3.1.2 硒醇的稳定和活化作用  47-48
      1.3.1.3 次硒酸的稳定性和反应性作用  48-50
      1.3.1.4 GSH结合位点  50-52
      1.3.1.5 硒硫化合物的反应性  52-54
    1.3.2 有机碲化合物模拟GPx  54-59
  1.4 参考文献  59-74
第二章本论文立论依据  74-81
  2.1 GSH含硒印迹蛋白质模拟GPx  76-77
  2.2 碲化枯草杆菌蛋白酶模拟GPx  77-78
  2.3 参考文献  78-81
第三章碲化枯草杆菌蛋白酶模拟GPx  81-122
  3.1 序言  81-85
  3.2 碲化枯草杆菌蛋白酶模拟GPx  85-118
    3.2.1 实验材料  85
    3.2.2 实验仪器  85-86
    3.2.3 实验方法  86-92
      3.2.3.1 碲氢化钠的制备  86
      3.2.3.2 碲化枯草杆菌蛋白酶的制备  86-88
      3.2.3.3 碲化枯草杆菌蛋白酶中碲含量的测定  88
      3.2.3.4 蛋白质浓度的测定  88
      3.2.3.5 碲硫化合物的制备  88-89
      3.2.3.6 碲化枯草杆菌蛋白酶的电泳分析  89
      3.2.3.7 碲化枯草杆菌蛋白酶的质谱分析  89
      3.2.3.8 碲化枯草杆菌蛋白酶的圆二色谱分析  89
      3.2.3.9 酶水解活性的测定  89-90
      3.2.3.10 模拟酶GPx活力的测定  90-91
        3.2.3.10.1 以谷胱甘肽为底物的测定法  90
        3.2.3.10.2 以TNB为底物的测定法  90-91
      3.2.3.11 pH值对模拟酶活性影响的测定  91
      3.2.3.12 动力学常数的测定  91-92
      3.2.3.13 碲化枯草杆菌蛋白酶的抑制实验  92
    3.2.4 结果与讨论  92-118
      3.2.4.1 碲化枯草杆菌蛋白酶的制备与表征  92-97
      3.2.4.2 碲化枯草杆菌蛋白酶的稳定性  97-100
      3.2.4.3 碲化枯草杆菌蛋白酶的水解活性  100-101
      3.2.4.4 TNB对碲化枯草杆菌蛋白酶的还原反应  101-104
      3.2.4.5 催化TNB对H_2O_2的还原反应  104-106
      3.2.4.6 酶促反应的动力学分析  106-110
      3.2.4.7 酶促反应的催化机制  110-112
      3.2.4.8 pH值对催化反应的影响  112-114
      3.2.4.9 抑制实验的结果  114-115
      3.2.4.10 硫醇底物特异性  115-117
      3.2.4.11 碲化枯草杆菌蛋白酶与天然GPx的比较  117-118
  3.3 本章小结  118-119
  3.4 参考文献  119-122
第四章碲化枯草杆菌蛋白酶的动力学研究  122-139
  4.1 序言  122-123
  4.2 碲化枯草杆菌蛋白酶的动力学研究  123-136
    4.2.1 实验材料  123-124
    4.2.2 实验仪器  124
    4.2.3 实验方法  124-125
      4.2.3.1 碲化枯草杆菌蛋白酶合成  124
      4.2.3.2 催化硫醇还原氢过氧化物反应动力学常数的测定  124-125
    4.2.4 结果与讨论  125-136
      4.2.4.1 硒化／碲化枯草杆菌蛋白酶酶促反应的不同表现  125-126
      4.2.4.2 催化TNB、NTP还原氢过氧化物的不同表现  126-130
      4.2.4.3 催化还原氢过氧化物动力学分析  130-136
  4.3 本章小结  136-137
  4.4 参考文献  137-139
第五章含硒生物印迹酶模拟GPx的研究  139-160
  5.1 序言  139-141
  5.2 含硒生物印迹酶模拟GPx  141-157
    5.2.1 实验材料  141-142
    5.2.2 实验仪器  142
    5.2.3 实验方法  142-147
      5.2.3.1 硒氢化钠的制备  142-143
      5.2.3.2 硒化枯草杆菌蛋白酶的制备  143-144
      5.2.3.3 蛋白质浓度的测定  144
      5.2.3.4 硒化枯草杆菌蛋白酶的电泳分析  144
      5.2.3.5 硒化枯草杆菌蛋白酶中硒含量的测定  144
      5.2.3.6 硒硫化合物的制备  144
      5.2.3.7 GSH含硒印迹蛋白质的制备  144-145
      5.2.3.8 印迹酶产率的测定  145-146
      5.2.3.9 印迹酶的圆二色谱分析  146
      5.2.3.10 印迹酶的GPx活性的测定  146
        5.2.3.10.1 以谷胱甘肽为底物的测定法  146
        5.2.3.10.2 以TNB为底物的测定法  146
      5.2.3.11 动力学常数的测定  146-147
    5.2.4 结果与讨论  147-157
      5.2.4.1 硒化枯草杆菌蛋白酶的合成与表征  147-148
      5.2.4.2 印迹酶的合成与表征  148-150
      5.2.4.3 印迹酶的GPx活性  150-153
      5.2.4.4 印迹酶酶促反应的动力学分析  153-156
      5.2.4.5 印迹酶的稳定性  156-157
  5.3 本章小结  157-158
  5.4 参考文献  158-160
结论  160-162
作者简历  162-164
致谢  164-165
中文摘要  165-169
英文摘要  169-174

半合成法构建GPx模拟酶

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