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芜菁花青素合成过程中相关基因的筛选及表达研究

作　者: 许志茹
导　师: 杨传平；李玉花
学　校: 东北林业大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 光芜菁 cDNA微阵列花青素基因表达
分类号: S631.4
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

以光敏感型不同的‘津田’和‘赤丸’两个芜菁品种为试材,构建了两个cDNA文库,对试材进行遮光处理和光照处理后构建了四个消减文库(1,津田光处理红色块根皮-津田暗处理白色块根皮;2,津田暗处理白色块根皮-赤丸光处理红色块根皮;3,津田暗处理白色块根皮-津田光处理红色块根皮;4,赤丸光处理和暗处理红色块根皮-津田暗处理白色块根皮)。从cDNA文库和消减文库中筛选特异基因片段并进行初步的生物信息学分析。同时将筛选到的特异基因片段体外扩增后点到玻片上构建cDNA微阵列。从不同光照处理的津田芜菁和赤丸芜菁试材中提取mRNA样品,在反转录过程中利用荧光标记物cy3和cy5标记cDNA,随后与芯片杂交以检测不同处理条件下津田芜菁和赤丸芜菁中基因群体的表达变化,从而筛选花青素生物合成过程中相关的结构基因群体和调节基因群体。利用紫外-可见分光光度计检测了津田芜菁和赤丸芜菁块根皮中花青素的积累与光照时间的相关关系。通过Northern杂交技术分别检测了遮光处理、日光处理、恒定光处理和UV-A处理条件下‘津田’和‘赤丸’芜菁块根皮中PAL、F3H、DFR、ANS和MYB等与花青素合成相关基因表达量的变化。主要研究结果如下: 1.从cDNA文库中筛选到618个特异基因片段。从消减文库中筛选出1424个特异基因片段,其中包括花色素生物合成途径所需酶的结构基因:PAL,CHS,F3H,DFR,ANS,同时也筛选到花色素生物合成相关的调控因子的编码序列,如bHLH,WD40,MYB和bZIP。将特异基因片段的PCR产物纯化后点到玻片上,成功地构建了cDNA微阵列。 2.将消减文库中的1424个特异基因片段填写到KEGG数据库的代谢途径中,从库1和库4中筛选到PAL,CHS,DFR和ANS等与花青素生物合成相关的基因片段,与预测的相同,这些基因参与津田芜菁和赤丸芜菁的花青素生物合成。比较反向构建的消减文库1和3发现,在消减文库1中筛选到的基因片段涉及54条代谢途径,其中包括类黄酮生物合成等特异的代谢途径。在消减文库4中筛选到的基因片段涉及48条代谢途径也包括类黄酮生物合成和生物碱生物合成的代谢途径。在库2中筛选到CHS、bHLH和bZIP的基因片段。 3.cDNA文库制备的芯片杂交结果显示,津田芜菁光下表达的基因数量多于黑暗条件下表达的基因,赤丸芜菁黑暗条件下表达的基因数量多于津田芜菁黑暗条件下表达的基因。某些基因的功能需要进一步验证。 4.消减文库制备的芯片杂交结果显示,UV-A处理和日光处理条件下,津田芜菁中表达的基因明显多于黑暗条件下表达的基因,同时有大量的与花青素生物合成相关的基因表达,由此证明UV-A处理和日光处理都可以使津田芜菁块根皮着色。 5.光敏感型津田芜菁块根皮中花青素含量与光照时间呈正相关关系;赤丸芜菁块根皮中花青素的积累与光照时间没有明显的相关关系。 6.Northern杂交结果表明:在津田芜菁中,恒定光和UV-A都可以诱导PAL、

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-13
1 绪论  13-32
  1.1 色素合成途径及相关基因  14-22
    1.1.1 类黄酮的结构  14
    1.1.2 花青素的生物合成途径  14
    1.1.3 花青素生物合成的结构基因所编码的酶  14-19
    1.1.4 色素生物合成的调节基因  19-22
  1.2 内在因素和外界环境对植物色素生物合成的影响  22-23
    1.2.1 内源激素的影响  22
    1.2.2 糖类物质的影响  22
    1.2.3 外界环境的影响  22-23
  1.3 光敏受体对花青素生物合成的影响  23-26
    1.3.1 光敏色素的影响  24-25
    1.3.2 蓝光和紫外光受体的影响  25-26
  1.4 微阵列在植物研究中的应用  26-28
    1.4.1 基因芯片的分类  26-27
    1.4.2 微阵列的应用  27-28
  1.5 研究情况及相关假设  28-30
  1.6 本项研究的目的和意义  30-32
2 cDNA文库的构建及阳性克隆的筛选  32-42
  2.1 试验材料  32
  2.2 试验试剂  32-33
    2.2.1 cDNA文库构建试剂盒  32
    2.2.2 筛选阳性克隆所需试剂  32-33
  2.3 试验方法  33-38
    2.3.1 总RNA的提取  33
    2.3.2 mRNA的纯化  33-34
    2.3.3 cDNA文库的构建  34-37
    2.3.4 cDNA文库中阳性克隆的筛选  37-38
  2.4 试验结果  38-40
    2.4.1 总RNA及mRNA的质量  38-39
    2.4.2 文库的滴度、重组率及质粒的提取结果  39-40
  2.5 讨论  40-41
  本章小结  41-42
3 消减文库的构建及阳性克隆的筛选  42-52
  3.1 试验材料  42
  3.2 试验试剂  42
    3.2.1 消减文库构建试剂盒  42
    3.2.2 筛选阳性克隆所需试剂  42
  3.3 试验方法  42-49
    3.3.1 总RNA的提取及mRNA的纯化  42
    3.3.2 消减文库的构建  42-47
    3.3.3 消减文库中阳性克隆的筛选  47-49
  3.4 试验结果  49-50
  3.5 讨论  50-51
  本章小结  51-52
4 cDNA文库和消减文库ESTs测序及分析  52-73
  4.1 试验试剂  52
    4.1.1 测序反应试剂盒及测序胶  52
    4.1.2 测序所需其他试剂  52
  4.2 试验方法  52-53
    4.2.1 cDNA文库和消减文库中ESTs序列的测定  52-53
    4.2.2 ESTs之间序列同源性的对比  53
    4.2.3 特异基因片段的功能聚类  53
  4.3 试验结果  53-68
    4.3.1 特异基因片段的筛选结果  53-62
    4.3.2 特异基因片段的功能聚类  62-66
    4.3.3 基因注释分类的比较  66-68
  4.4 讨论  68-72
    4.4.1 关于cDNA文库和消减文库中特异基因片段的筛选  68-69
    4.4.2 关于特异基因片段的功能聚类和基因注释分类  69-72
  本章小结  72-73
5 cDNA微阵列的制备及芯片杂交  73-86
  5.1 试验试剂  73
    5.1.1 PCR反应和纯化试剂盒  73
    5.1.2 芯片杂交所需试剂  73
  5.2 试验方法  73-76
    5.2.1 特异基因片段的PCR扩增及纯化  73-74
    5.2.2 芯片杂交及检测  74-76
  5.3 试验结果  76-83
    5.3.1 特异基因片段的扩增和纯化结果  76
    5.3.2 芯片杂交结果  76-83
  5.4 讨论  83-85
    5.4.1 关于特异基因片段的扩增和纯化  83-84
    5.4.2 关于芯片杂交结果  84-85
  本章小结  85-86
6 与花青素生物合成相关的基因表达分析  86-105
  6.1 试验试剂  86
    6.1.1 色素提取试剂  86
    6.1.2 Northren杂交试剂  86
    6.1.3 酶和其它生化试剂  86
  6.2 试验方法  86-90
    6.2.1 芜菁块根皮色素含量测定  86-87
    6.2.2 芜菁块根皮总RNA提取方法  87
    6.2.3 花青素合成相关基因的引物设计  87
    6.2.4 探针的合成  87-89
    6.2.5 Northern杂交  89-90
  6.3 试验结果  90-102
    6.3.1 芜菁块根皮花青素含量的测定  90-96
    6.3.2 Northern杂交结果  96-102
  6.4 讨论  102-104
    6.4.1 关于芜菁块根皮花青素含量测定的讨论  102
    6.4.2 关于Northern杂交结果的讨论  102-104
  本章小结  104-105
结论  105-107
参考文献  107-120
附录  120-133
攻读学位期间发表的学术论文  133-134
致谢  134

芜菁花青素合成过程中相关基因的筛选及表达研究

内容摘要

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