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大麦黄矮病毒和蚜虫诱导的小麦防御基因的分离及基因沉默体系的建立

作　者: 刘晓东
导　师: 辛志勇；张增艳
学　校: 中国农业科学院
专　业: 作物遗传育种
关键词: 小麦抑制消减杂交蚜虫大麦黄矮病毒 cDNA-AFLP 病毒诱导的基因沉默
分类号: S512.1
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

小麦黄矮病是由大麦黄矮病毒(Barley Yellow Dwarf Virus,BYDV)引起的重要病毒病,是小麦的主要病害之一,经常造成巨大损失。大麦黄矮病毒不能通过摩擦接种,只能靠蚜虫咬食接种和传播。小麦的近缘种—中间偃麦草,对大麦黄矮病毒具有高度抗性,包含三个抗黄矮病基因。其中有一个基因被精确定位在中间偃麦草7X(St)染色体长臂端部,被命名为Bdv2。通过远缘杂交方法,选育出一系列携带Bdv2的抗黄矮病小麦异源易位系,如YW642等。研究表明,植物抗病基因编码的蛋白质决定着寄主植物能否打开抗病系统或打开该系统的程度,真正起抗病作用的是诱导表达的防御基因的产物。因此在抗病植株中筛选和分离BYDV诱导表达的基因,并分析它们的功能,对于了解小麦抗BYDV的机制,开辟小麦抗病新途径,保证小麦的稳产高产具有非常重要的意义。首先通过半定量RT-PCR的方法,研究了BYDV-GAV在YW642及其感病姊妹系植株中,在时间和空间上积累的差异,在分子水平上证明了YW642对BYDV的高度抗性。结果还表明,抗病植株在病毒侵染后诱导防御基因表达的大致时间在接种饲毒蚜48小时-72小时之前,为从抗病植株中分离防御反应基因、研究抗病基因表达谱提供了取样的依据。抑制差减杂交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)技术被首先用于筛选BYDV诱导表达的基因。首先构建了饲BYDV-GAV蚜虫诱导的SSH文库。从该SSH文库中筛选出22个杂交信号差异显著的克隆。利用半定量RT-PCR进一步验证,确证其中6个为蚜虫诱导上调表达的cDNA克隆,其中有3个分别与圆锥小麦基因组上不同位点的反转录转座子序列有94%、93%和87%的一致性,另外3个cDNA克隆分别与普通小麦的PR-4基因有97%的一致性、与β—1,3—葡聚糖酶基因有94%的一致性以及与大麦的低温反应RNA结合蛋白基因有91%的一致性。本研究分离的6个cDNA克隆都是对蚜虫应答反应的基因,这为阐明小麦对蚜虫的防御机制,进一步克隆小麦中蚜虫诱导型启动子奠定了基础。以接种饲毒蚜48小时、72小时和接种无毒蚜48小时、72小时的YW642样品被首先作为研究对象。通过cDNA-AFLP方法,筛选出YW642被BYDV诱导表达的片段109个,然后在此基础上,加入感病姊妹系接种饲毒蚜48小时、72小时样品同时再次进行cDNA-AFLP分析,以排除小麦遗传背景对BYDV的本能防御反应。最后分离到12个BYDV诱导的、特异性地在抗病植株中表达的基因片段。反向Northern分析验证了其中的两个基因片段。对验证的两个基因片段进行Southern分析,结果表明其中一个基因在抗感小麦基因组中都存在,并且为单拷贝,序列分析表明可能代表的是新基因。这是第一次分离到在抗黄矮病小麦中被BYDV诱导表达的基因片段,为揭示小麦抗黄矮病机制打下了良好的基础。利用病毒诱导基因沉默(VIGS)的载体系统,首次在小麦上建立了病毒诱导的基因沉默体系,确定了第四叶是基因沉默效果最佳的部位。小麦基因沉默体系的建立为快速分析小麦及其近缘种新基因的功能提供了新的有力工具。

全文目录

第一章引言  10-32
  1 植物的抗病毒机制  10-17
    1.1 植物抗病基因介导的病毒抗性  10-12
    1.2 病原物衍生抗性  12-13
    1.3 利用转录后基因沉默(PTGS)机制获得病毒抗性  13-16
    1.4 其它策略  16-17
  2 病毒诱导的基因沉默  17-22
    2.1 简介  17-20
    2.2 VIGS的优化  20
    2.3 VIGS的实际操作问题  20-21
    2.4 VIGS的评估  21-22
  3 小麦黄矮病研究进展  22-25
    3.1 概述  22-23
    3.2 大麦黄矮病毒特性  23-24
    3.3 小麦黄矮病抗源  24-25
  4 分离差异表达基因的方法  25-29
    4.1 抑制差减杂交  25-28
    4.2 cDNA-AFLP  28-29
  5 立题意义及技术路线  29-32
    5.1 立题意义  29-31
    5.2 技术路线  31-32
第二章大麦黄矮病毒在抗、感植株中的时空积累  32-42
  1 材料与方法  32-35
    1.1 材料  32
    1.2 方法  32-35
  2.结果  35-39
    2.1 RNA样品的质量检测  35-37
    2.2 大麦黄矮病毒GAV株系的复制酶基因与外壳蛋白基因片段的克隆测序  37-38
    2.3 不同起始模板量的PCR扩增比较  38-39
    2.4 大麦黄矮病毒在小麦体内的积累演变过程  39
  3.讨论  39-42
第三章饲毒蚜虫诱导的YW642差减文库的构建与筛选  42-59
  1 材料与方法  42-48
    1.1 材料  42-43
    1.2 方法  43-48
  2 结果  48-57
    2.1 文库构建样品的总RNA质量检测结果  48
    2.2 SSH差减效率分析  48-49
    2.3 差减文库的插入片段大小  49-50
    2.4 差减文库的筛选  50-51
    2.5 半定量RT-PCR验证结果及其序列分析  51-57
  3.讨论  57-59
第四章大麦黄矮病毒诱导的YW642差异表达基因的cDNA-AFLP筛选  59-71
  1 材料与方法  59-66
    1.1 材料  59
    1.2 方法  59-66
  2 结果  66-69
    2.1 总RNA质量检测结果  66
    2.2 差异表达片段的筛选  66-68
    2.3 差异表达片段的回收  68
    2.4 差异片段的反向Northern验证和Southern分析  68-69
  3 讨论  69-71
第五章基因功能快速分析体系的建立  71-83
  1 材料与方法  71-75
    1.1 材料  71-72
    1.2 方法  72-75
  2 结果  75-80
    2.1 小麦PDS基因cDNA片段的克隆与序列分析  75-76
    2.2 VIGS载体的线性化  76
    2.3 小麦PDS基因沉默的观察  76-78
    2.4 小麦PDS基因沉默的分子检测  78-80
  3 讨论  80-83
第六章结论  83-84
参考文献  84-98
致谢  98-99
作者简历  99

大麦黄矮病毒和蚜虫诱导的小麦防御基因的分离及基因沉默体系的建立

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