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红树耐盐相关蛋白的分离和MALDI-TOF质谱鉴定

作　者: 彭存智
导　师: 郑学勤
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 红树耐盐相关蛋白双向电泳 MALDI-TOF质谱
分类号: Q946.1
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
下　载: 307次
引　用: 2次
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内容摘要

本项目的目的就是希望能充分利用海南特有而丰富的红树林资源,从中选取理想的品种作为实验材料,迅速而又高效的分离和鉴定红树林植物耐盐相关蛋白。项目的成功,使海南丰富的红树林资源发挥出重要的种质资源库作用,为植物耐盐性的研究和应用开辟了一条新的道路。本项目通过双向电泳技术分离在500 mmol/L NaCl溶液处理12天后表达量增加的蛋白质,再经过MALDI-TOF质谱鉴定和蛋白质数据库,检索同源的蛋白质,从而得到该蛋白的氨基酸序列。通过对双向电泳图谱的初步观察可以看到,蛋白质主要集中在等电点5—8和分子量28KD—66KD之间。接着将蛋白质双向电泳图输入双向电泳分析软件进行分析,根据凝胶报告,红树幼苗叶片在淡水处理后的蛋白质双向电泳图中大约有904个蛋白点,NaCl溶液处理12天后的蛋白质双向电泳图中大约有967个蛋白点,其中蛋白点匹配成对的有790对。通过搜索软件分析后得到的蛋白点群柱状图,然后根据凝胶图像在视觉上直接观察和比较蛋白点,最终挑选出15个在NaCl溶液处理后表达量增加的蛋白点用于MALDI-TOF质谱鉴定,并将鉴定结果在蛋白质数据库中进行检索。结果表明,17#样品与(CATA3_SOYBN)Catalase 3的匹配分数是80,匹配显著,同时分子量和等电点pI比较接近,因此可以认为17#样品是(CATA3_SOYBN)Catalase 3;29#样品与(ATPB_CUSRE)ATP synthase beta chain的匹配分数是191,匹配显著,同时分子量和等电点pI比较接近,可以认为29#样品是(ATPB_CUSRE)ATP synthase betachain;53#样品和43#、45#、52#样品的肽段峰一样,应该是同一类蛋白。其中,53#样品与(RCA_ARATH)Splice isoform Short的匹配分数是78,达到了显著,可以认为53#样品是(RCA_ARATH)Splice isoform Short,但根据该蛋白的功能特点,(RCA_ ARATH)Splice isoform Short对耐盐方面的作用不是太大。其余49#、63#、64#、66#、85#、87#、88#和94#样品的MALDI-TOF质谱鉴定结果在蛋白质数据库中进行检索都没有得到可信的结果。

全文目录

1.前言  7-31
  1.1.植物耐盐机理研究进展  9-14
    1.1.1.渗透调节  10
    1.1.2.离子的平衡  10-13
    1.1.3.水通道蛋白的调控  13
    1.1.4.改变光合作用途径  13-14
    1.1.5.抗氧化防御系统  14
  1.2.植物耐盐细胞工程研究进展  14-16
  1.3.植物耐盐基因工程及耐盐转基因工程研究进展  16-25
    1.3.1.渗透胁迫保护剂相关基因：  16-20
    1.3.2.离子平衡相关基因  20-22
    1.3.3.水通道蛋白相关基因MipA、MipB、MipC  22
    1.3.4.多胺类物质合成相关基因ADC、ODC、SAMDC  22-23
    1.3.5.渗调蛋白相关基因NP24  23
    1.3.6.晚期胚胎发生富集蛋白(LEA蛋白)相关基因  23-25
  1.4.红树林植物盐诱导相关基因研究进展  25-27
  1.5.蛋白质组学主要研究技术概述  27-31
    1.5.1.特异性研究材料的获得——LMD技术  27
    1.5.2.蛋白质的分离——双向电泳(2-DE)技术  27-29
    1.5.3 蛋白质的鉴定——质谱(mass spectrometry)技术  29-31
2.材料与方法  31-40
  2.1.实验材料的准备  31-32
    2.1.1.实验材料的分布和选择  31
    2.1.2.实验材料的处理和收集  31-32
  2.2.实验方案设计和技术路线  32-33
  2.3.实验方法  33-40
    2.3.1.红树叶片蛋白质的提取(Phenol提取法，改良)  33
    2.3.2.蛋白质的定量检测(Bradford改良法)  33-34
    2.3.3.蛋白质双向电泳(2-D electrophorysis)  34-37
    2.3.4.SDS-PAGE凝胶的检测  37-38
    2.3.5.2—D凝胶图象分析  38
    2.3.6.凝胶胶内原位酶解及MALDI-TOF质谱鉴定  38-40
3.结果分析  40-69
  3.1.实验材料的处理  40
  3.2.红树叶片蛋白质的提取  40
  3.3.蛋白质的定量检测  40-41
  3.4.蛋白质双向电泳及检测分析  41-53
    3.4.1.散点图  47-49
    3.4.2.蛋白点群的描述统计学分析  49
    3.4.3.蛋白点群的柱状图  49-53
  3.5.凝胶胶内原位酶解及MALDI-TOF质谱鉴定  53-58
  3.6.MALDI-TOF质谱鉴定结果在蛋白质数据库中的检索  58-69
4.讨论  69-71
  4.1.从蛋白质途径分离、克隆基因的可行性  69
  4.2.实验材料的选取  69
  4.3.红树叶片蛋白质的提取  69-70
  4.4.所鉴定蛋白在耐盐机制中的功能研究及推测  70-71
5.结论  71-72
参考文献：  72-82
附录：各种主要试剂、溶液的配制  82-87
致谢  87

红树耐盐相关蛋白的分离和MALDI-TOF质谱鉴定

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