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小麦及近缘种属籽粒硬度、多酚氧化酶性状的分子机理研究

作　者: 常成
导　师: 刘广田
学　校: 中国农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 小麦近缘种属籽粒硬度 PPO 分子机理
分类号: S512.1
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

小麦籽粒硬度是胚乳质地的反映,它是国际通用小麦分类指标之一,与磨粉品质、食品加工品质关系密切。硬度主要受pina和pinb基因控制,若其发生突变,籽粒一般表现为硬质。多酚氧化酶(PPO)是导致鲜湿面条、馒头、饺子发生褐变的主要因素。本文对这两性状及其分子机理进行了研究,主要结论如下: 1 普通小麦,特别是地方品种和农家品种pina和pinb等位变异较为丰富,共发现1个新的pina变异和3个新的pinb变异,均为单核苷酸突变,与硬度的变异关系较密切。西藏半野生小麦、密穗小麦、Spelt、粗山羊草未发现变异,野生二粒小麦及偃麦草则缺失此基因。本文改进的Urea-SDS-PAGE凝胶电泳和普通TBE-PAGE凝胶相比,前者的分辨率显著高于后者,可检测单核苷酸突变。在DNA水平上检测pina和pinb的效率要高于蛋白质水平,不需设计不同的位点特异性引物,适于等位变异及单核苷酸多态性(SNP)的分析。 2 在小麦籽粒不同发育阶段,软硬质小麦胚乳中总Puroindolines(PinA和PinB)蛋白的表达差异不大,但淀粉颗粒结合的Puroindolines蛋白量差异非常明显,发育各阶段,软质小麦显著高于硬质小麦。基因同为野生型但硬度有差异的品种,其淀粉表面结合的Puroindolines蛋白量差异也明显,说明此结合特点是决定籽粒硬度的直接原因。 3 SDS可以显著提高PPO的提取效率,增加品种间差异,利于PPO活性的筛选。在某些品种间,PPO活性表现出不同的时间特性和温度特性。在普通小麦及其近缘种属中,籽粒PPO活性变异很大,但基本上偏向于中低活性分布。一些普通小麦品种PPO活性很低,在育种和研究上具有较高的应用价值。一般来说,六倍体小麦(AABBDD)活性高于粗山羊草(DD),而野生二粒小麦(AABB)活性很低。其中偃麦草的活性也较高。 4 利用中国春的缺体-四体材料,将两个PPO基因(PPO-1,PPO-2)分别定位在2A和2D上。它们均表现出一定的等位变异,尤其是PPO-2基因变异较为丰富。在PPO-1等位基因中,以a类型最多;而PPO-2等位基因中,以D型为主。这些等位基因中,其PPO活性分布较广泛,大都偏向于中低活性,活性过高或过低的品种较少。PPO-2等位基因中,A、B、E和F型的PPO活性较高;而H、I、D~*、K以及缺失类型的PPO活性则较低。 5 PPO-2基因两功能区之间存在一内含子,材料间有变异;PPO-2基因功能区序列同源性较高,但其变异将会对PPO活性产生一定的影响。小麦籽粒PPO同工酶随着籽粒的成熟而减弱(A、C区除外),低活性品种的减弱程度大于高活性品种。高活性品种其C区同工酶却逐渐增强,和籽粒PPO活性变化一致,而低活性品种正相反。在转录水平上,PPO-2基因表达在发育过程中逐渐增强,与PPO活性变化、C区同工酶的表达规律较一致,高活性品种表达水平一般高于低活性品种。表明,PPO-2基因与籽粒发育阶段PPO活性及C区同工酶表达有关。 6 收获并通过后熟的籽粒与发育后期籽粒相比,PPO活性显著降低、同工酶减弱,数目减少,PPO活性高低与其同工酶带的强弱一致。一些低PPO活性品种,甚至检测不到同工酶。籽粒萌动时,PPO活性升高,同工酶带增强,24小时后逐渐降低,同工酶带开始减弱。 7 抗坏血酸可有效地抑制小麦籽粒PPO活性,适量的抗坏血酸能显著抑制褐变,改善面片的色泽,在面食品加工中有着广阔的应用前景。

全文目录

第一章文献综述  16-29
  1 国内外研究现状分析  16-26
    1.1 小麦籽粒硬度  16-22
      1.1.1 小麦籽粒胚乳结构与硬度  16-17
      1.1.2 小麦籽粒硬度的生化基础  17-19
        1.1.2.1 Friabilin／Puroindolines蛋白与小麦籽粒硬度  17-18
        1.1.2.2 脂类物质与籽粒硬度  18
        1.1.2.3 戊聚糖与籽粒硬度的关系  18-19
      1.1.3 小麦籽粒硬度的遗传及其分子机理  19-20
      1.1.4 小麦近缘种属的Puroindoline蛋白及其基因的研究  20-21
      1.1.5 籽粒质地(硬度)与小麦品质的关系  21
      1.1.6 环境对籽粒硬度的影响  21
      1.1.7 Puroindolines蛋白与植物的抗病性  21-22
    1.2 小麦籽粒多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)  22-26
      1.2.1 小麦PPO对品质的影响  22
      1.2.2 多酚氧化酶的分类  22-23
      1.2.3 PPO在小麦体内的分布和变化  23
      1.2.4 PPO的生理生化功能  23
      1.2.5 小麦籽粒PPO提取与活性测定  23-24
      1.2.6 PPO活性的影响因素  24-25
      1.2.7 小麦PPO遗传及分子生物学研究  25-26
  2 立论依据、研究方案  26-29
    2.1 立论依据  26-27
    2.2 研究方案  27-29
      2.2.1 研究目标  27
      2.2.2 研究内容  27-29
第二章小麦籽粒硬度的研究  29-53
  第一节小麦籽粒Puroindolines蛋白的提取与分离检測  29-35
    1 材料与方法  29-31
      1.1 试验材料  29-31
      1.2 Puroindolines蛋白的提取及分离  31
      1.3 小麦籽粒硬度测定  31
    2 结果和分析  31-33
      2.1 Puroindolines蛋白的普通SDS-PAGE凝胶电泳  31-32
      2.2 Puroindolines蛋白的Urea-SDS-PAGE电泳  32-33
      2.3 PinA、PinB蛋白电泳带型与籽粒硬度  33
    3 讨论  33-35
  第二节小麦籽粒中Puroindolines蛋白的动态表达  35-40
    1 材料与方法  35-36
      1.1 试验材料  35-36
      1.2 试验方法  36
    2 结果与分析  36-38
      2.1 籽粒不同发育阶段PinA的PinB表达  36-37
      2.2 相同pina、pinb基因型(pina-D1a,pinb-D1a／pinb-D1p)表达及硬度差异  37-38
    3 讨论  38-40
  第三节 pina、pinb等位基因变异的研究  40-49
    1 材料与方法  40-42
      1.1 试验材料  40
      1.2 试验方法  40-42
    2 结果与分析  42-47
      2.1 Puroindolines(PinA、PinB)蛋白的分离和检测  42
      2.2 Puroindolines基因的PCR扩增及检测  42-45
      2.3 pina、pinb的变异分析  45-47
      2.4 推导氨基酸的初步分析  47
    3 讨论  47-49
  第四节小麦籽粒硬度与其它品质性状的相关分析  49-53
    1 材料与方法  49-50
      1.1 材料  49
      1.2 品质测定方法  49-50
      1.3 数据用SPSS统计软件分析  50
    2 结果与分析  50-51
      2.1 品质性状变异  50
      2.2 籽粒硬度与其它品质性状的相关分析  50
      2.3 碱水保持力(AWRC)与其他品质性状的回归分析  50-51
      2.4 SDS与其它品质性状的回归分析  51
    3 结论与讨论  51-53
第三章小麦籽粒多酚氧化酶研究  53-96
  第一节籽粒多酚氧化酶的提取与测定  53-59
    1 材料与方法  53-54
      1.1 试验材料  53
      1.2 PPO提取与活性测定  53-54
      1.3 比较SDS和磷酸盐提取PPO活性的时间特性  54
      1.4 37℃水浴和室温下，PPO活性的时间特性  54
    2 结果与分析  54-57
      2.1 不同方法提取PPO活性比较  54-55
      2.2 SDS与磷酸盐提取全麦粉PPO的活性变化及时间特性  55-56
      2.3 室温下和37℃水浴条件下PPO吸光度的变化  56-57
    3 讨论  57-59
  第二节普通小麦及其近缘种属PPO活性的变异研究  59-64
    1 材料和方法  59-61
      1.1 试验材料  59-61
      1.2 试验方法  61
    2 结果与分析  61-63
      2.1 普通小麦及其近缘种属的PPO活性变异分析  61-62
      2.2 PPO活性分布  62-63
    3 讨论  63-64
  第三节小麦多酚氧化酶基因初步定位  64-67
    1 材料和方法  64-65
      1.1试验材料  64
      1.2 试验方法  64-65
    2 结果与分析  65-66
      2.1 PPO-1和PPO-2基因的染色体定位  65-66
    3 讨论  66-67
  第四节小麦PPO-1和PPO-2基因多态性与PPO活性关系的研究  67-74
    1 材料与方法  67-68
    2 结果与分析  68-72
      2.1 PPO-1和PPO-2多态性分析  68-70
      2.2 PPO-1和PPO-2多态性分布及与PPO活性的关系  70-72
    3 讨论  72-74
  第五节籽粒PPO基因分子机理及动态表达的初步研究  74-86
    1 材料与方法  74-77
      1.1 试验材料  74-75
      1.2 试验方法  75-77
    2 结果与分析  77-84
      2.1 PPO-2基因功能区序列分析  77-79
      2.2 PPO一2功能区域推导氨基酸分析  79-81
      2.3 小麦籽粒PPO同工酶分析  81-83
        2.3.1 籽粒不同发育阶段PPO同工酶的表达  81-82
        2.3.2 成熟籽粒及萌动时期PPO同工酶分析  82-83
      2.4 PPO-2基因转录水平的动态分析  83-84
    3 讨论  84-86
  第六节抗坏血酸对籽粒PPO活性的影响  86-91
    1 材料与方法  86-87
      1.1 试验材料  86
      1.2 PPO提取、活性测定及Vc对其的影响  86-87
    2 结果与分析  87-90
      2.1 分光光度法与酶标仪法测定PPO活性的比较  87-88
      2.2 Vc对籽粒PPO活性的影响  88-89
      2.3 Vc对籽粒PPO活性抑制的持续性和稳定性  89-90
    3 讨论  90-91
  第七节抗坏血酸对面片色泽的影响  91-96
    1 材料与方法  91-92
      1.1 试验材料  91
      1.2 制粉  91
      1.3 面片的制作  91
      1.4 面片色泽测定  91-92
      1.5 不同Vc含量对面片色泽的影响  92
      1.6 Vc对面片色泽、PPO活性的持续性影响  92
    2 结果与分析  92-94
      2.1 不同含量的Vc对面片色泽的影响  92-93
      2.2 Vc处理后，面片在0-12h内色泽的变化  93-94
      2.3 Vc对面片PPO活性的影响  94
    3 讨论  94-96
结论  96-98
参考文献  98-111
致谢  111-112
个人简介  112

小麦及近缘种属籽粒硬度、多酚氧化酶性状的分子机理研究

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