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SIRP α及Gankyrin在神经发育和分化中的表达调控和作用研究

作　者: 康斌
导　师: 王红阳
学　校: 第二军医大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: SIRPα 神经分化神经发育 Gankyrin NF-κ B JNK
分类号: Q42
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

SIRP α和Gankyrin在神经系统中具有高水平表达，其中SIRP α是目前唯一在神经系统中表达的抑制性受体，提示它们在神经系统发育和功能中可能具有独特作用。我们通过建立小鼠胚胎发育模型，揭示了SIRP α和Gankyrin在脑组织发育过程中的表达模式；并利用NGF诱导PC12细胞神经分化体外模型，研究了两者在神经分化中的生物学作用和调控机制。利用抗SIRP α抗体对小鼠神经发育不同阶段的脑组织蛋白裂解液进行Western blot分析显示，随着脑组织不断发育成熟，SIRP α表达逐渐增强，在出生后40天达到高峰。取不同胎龄和出生后不同时间的小鼠脑组织进行原位杂交和免疫组化分析，结果显示，在胚胎脑组织中SIRP α表达信号较弱，而在出生后脑组织中SIRP α有高表达，主要表达于小鼠大脑和小脑皮质分子层，小脑颗粒细胞层亦有弱表达。原位杂交结果表明小脑蒲肯野氏细胞中SIRP α mRNA表达最强，而在大脑皮层中多种细胞均有SIRP α mRNA表达，其中锥体细胞表达信号最为明显。利用NGF诱导PC12细胞神经分化发现，PC12细胞在NGF刺激9天发生不可逆神经分化后，Western blot显示SIRP α表达出现上调。对SIRP α转染PC12细胞在有无NGF刺激情况下的增殖情况进行MTT检测结果显示，无NGF刺激时，SIRP α转染PC12比对照细胞增殖快；但有NGF刺激情况下，SIRP α转染PC12细胞与对照细胞均表现为细胞增殖停滞。与对照细胞相比，SIRP α转染细胞在NGF刺激后的形态分化能力大为下降，差异具有显著性(P＜0.001)。利用抗磷酸化JNK抗体检测NGF刺激后不同时间JNK活化性磷酸化改变，结果显示，与空白对照细胞相比，SIRP α转染细胞的基础水平JNK磷酸化水平下降；利用NF-κ B荧光素酶报告基因对SIRP α转染PC12细胞中NF-κ B活性检测结果显示，与对照细胞相比，转染SIRP α引起NF-κ B报告活性显著上升(P＜0.01)；第二军医大学博士学位论中文摘要NGF刺激后，各细胞中NF一KB活性进一步上调，SIRP。转染PC12与其他对照细胞的上调幅度均相似。 Westem Blot结果显示在NGF刺激PC12细胞后Gankyrin表达也出现上调，上调时相早于SIRP。在NGF刺激后的表达上调时相。NGF诱导后30分钟，Gank州n蛋白表达即出现上调，随刺激时间延长其表达继续维持较高水平，对照胎牛血清刺激则不影响Gankyrin表达。对组织蛋白裂解液进行w七stem Blot分析，结果显示Gankyrin在小鼠胚脑中无明显表达，但出生后脑组织中表达逐渐增高。免疫组化结果也显示，与胚胎组织相比，Gankyrin在出生后小鼠脑组织中表达出现明显上升;其表达广泛分布于皮层各层细胞，其中在海马区表达最高，其表达主要位于海马部位细胞核。利用不同信号通路特异性抑制剂处理PC 12，W七stem Blot分析各抑制剂处理所引起Gankyrin表达改变情况，结果表明，PI3K抑制剂Wortamannin，Erk抑制剂pD98059和IKK抑制剂BAYH一7082处理使NGF诱导的Gank州n上调趋势减弱，这种抑制效应呈剂量依赖关系，其中IKK抑制剂BAYH一7082抑制作用最为明显;p38特异抑制剂SB203580处理对NGF诱导的Gankyrin表达具有增强作用，这种增强作用也表现剂量依赖关系。 SIRP。和Gankyrin在神经发育成熟过程中的表达模式以及其各自的分子生物学功能显示sIRP“和G肛水yrin可能分别参与神经细胞突起生长的精细调节及突触功能和神经细胞存活等功能的调控。本文部分研究结果已投送Moleeular Brain Researeh杂志(已修回)。

全文目录

缩略词表  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要(ABSTRACT)  8-10
第一部分 SIRPα在小鼠神经发育过程中的表达  10-40
  前言  10-12
  试剂与仪器  12-15
    1 材料  12
    2 主要化学药品和试剂  12-14
    3 主要实验仪器  14-15
  实验方法  15-28
    1 小鼠胚胎模型建立  15
    2 取材和切片  15-16
    3 感受态细胞制备  16
    4 质粒转化  16
    5 质粒小量抽提  16
    6 质粒大量抽提  16-17
    7 GST-SIRPα跑内区片段融合蛋白质体外表达和纯化  17-18
    8 兔抗人SIRPα胞内区抗体的制备、纯化和鉴定  18-21
    9 抗SIRPα跑内区抗体对小鼠脑组织切片行免疫组织化学染色  21-22
    10 组织总蛋白提取和浓度测定  22-23
    11 Western Blot  23
    12 SIRPα引物设计  23
    13 SIRPα胞内区序列正义和反义RNA探针合成  23-26
    14 原位杂交检测SIRPα表达  26-28
  实验结果  28-36
    1 兔抗SIRPα抗体的制备、纯化与鉴定  28-29
    2 SIRPα原位杂交探针制备  29-31
    3 SIRPαmRNA在小鼠脑组织中的表达定位  31-33
    4 SIRPα蛋白在脑组织中的定位  33-34
    5 SIRPα在脑发育过程中的表达改变  34-36
  讨论  36-38
  文献  38-40
第二部分 SIRPα在PC12神经分化过程中的作用研究  40-69
  前言  40-41
  试剂和仪器  41-44
    1 材料  41-42
    2 主要试剂配置  42-43
    3 主要仪器  43-44
  实验方法  44-50
    1 PC12细胞培养  44
    2 建立SIRPαWT基因稳定转染PC12细胞系  44-47
    3 细胞增殖实验  47-48
    4 NGF诱导PC12细胞神经分化分析  48
    5 荧光素酶报告基因分析  48
    6 免疫沉淀  48-49
    7 细胞免疫荧光染色  49-50
  实验结果  50-60
    1 SIRPα在NGF诱导PC12细胞神经分化后的表达  50-51
    2 稳定表达野生型SIRPαPC12细胞系的建立和鉴定  51-52
    3 稳定转染SIRPαPC12细胞增殖能力检测  52-54
    4 SIRPα对NGF刺激PC12细胞神经分化反应的影响  54
    5 SIRPα胞内区缺失突变体对NGF刺激的PC12神经分化的影响  54-57
    6 SIRPα表达对PC12细胞中NF-κB活化的影响  57-58
    7 SIRPα对PC12细胞中MAPK通路活化的影响  58-59
    8 SIRPα对NGF诱导PC12细胞神经分化过程中ankyrin重复结构域蛋白  59-60
      Gankyrin蛋白表达的调节  59-60
  讨论  60-66
    1 NGF刺激PC12细胞神经分化后SIRPα表达上调的意义  60-62
    2 SIRPα对NGF诱导PC12细胞形态分化过程的抑制及其意义  62-64
    3 SIRPα对NGF诱导PC12细胞形态分化抑制的机制  64-65
    4 SIRPα对PC12细胞中NF-κB活性的调节  65
    5 SIRPα对NGF诱导不同信号传导通路的不同效应  65-66
    6 SIRPα对NGF诱导神经分化过程中Gankyrin表达上调的促进  66
  文献  66-69
第三部分 Gankyrin在NGF诱导PC12神经分化过程中的表达调控研究  69-83
  前言  69-70
  试剂与仪器  70-71
    1 材料  70-71
    2 主要化学药品和试剂  71
    3 主要实验仪器(同第二部分)  71
  实验方法  71-74
    1 小鼠胚眙模型建立、取材和免疫组化石蜡包埋切片(同第一部分)  71
    2 组织总蛋白提取和浓度测定(同第一部分)  71
    3 抗Gankyrin抗体对小鼠脑组织切片行免疫组织化学染色  71-72
    4 NGF刺激PC12细胞及MAPK激酶抑制剂处理  72-74
    5 Western Blot分析(同第一和第二部分)  74
  实验结果  74-79
    1 Gankyrin在小鼠脑发育过程中的表达改变  74-75
    2 Gankyrin在脑组织中表达定位  75-76
    3 Gankyrin在神经发育过程中表达调控机制  76-79
  讨论  79-81
  文献  81-83
[综述一]  83-95
  信号调节蛋白研究进展  83-95
[综述二]  95-112
  Current understanding of the signal transduction in HCC  95-112
致谢  112

SIRP α及Gankyrin在神经发育和分化中的表达调控和作用研究

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