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TIE2配体寡肽的设计、筛选及其在基因治疗中的靶向导入作用

作　者: 吴向华
导　师: 顾健人
学　校: 复旦大学
专　业: 病原生物学
关键词: Tie2 促血管生成素2 噬菌体展示配体寡肽
分类号: R346
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

肿瘤基因治疗将成为除手术、放疗和化疗等方法外又一新的抗癌策略。尤其在抗肿瘤转移和复发方面将起重要作用。目前还缺乏将基因导入人体细胞的高效靶向性载体系统,这是基因治疗至今尚未成为临床常规治疗措施的关键因素之一。因此研发一种高效靶向性基因导入系统成为当务之急。本研究旨在建立一种靶向Tie2受体的非病毒基因导入系统并检验其有效性,为今后肿瘤的基因治疗提供可靠的理论依据与实践指导。第一部分Tie2配体寡肽的设计与筛选【目的】掌握特定受体的配体寡肽的设计与筛选方法;获得Tie2受体的候选配体寡肽; 【方法】 ⑴ 应用基于Tie2受体天然配体Angiopoietin-2的同源序列比较/二级结构分析及疏水性分析方法设计Tie2受体的配体寡肽并化学合成; ⑵ RT-PCR 和Western Bloting筛选Tie2阴性表达细胞株;构建pCDNA3.0-ExTie2质粒并转染Tie2表达阴性细胞,G418筛选出Tie2稳定表达细胞系;分别以重组人Tie2融合蛋白(rh-Tie2/Fc)与稳定表达Tie2受体的细胞为筛选靶,用噬菌体展示随机12肽库进行筛选。经过5轮筛选的噬菌体,经测序、ELISA、免疫组化及噬菌体回收试验鉴定出高度富集的阳性噬菌体克隆;然后化学合成高亲和力阳性噬菌体克隆展示肽。【结果】基于Tie2受体的配体Angiopoietin-2 设计的22肽命名为GA3(WTIIQRREDGSVDFQRTWKEYK);筛选到Tie2阴性表达细胞株SMMC7721; 建立了Tie2稳定表达细胞系SMMC7721-ExTie2;以rh-Tie2/Fc与SMMC7721-ExTie2为筛选靶获得的高亲和力富集噬菌体展示肽序列羧基端各加一个酪氨酸后分别命名为GA4<WP=5>(HATGTHGLSLSHY)和GA5(NSLSNASEFRAPY)。【结论】本研究使用的设计及筛选方法可能是获得受体的配体寡肽的一种可行途径;候选的配体寡肽需要进一步鉴定。

全文目录

中文摘要  4-7
英文摘要  7-10
前言  10-13
第一部分 Tie2配体寡肽的设计与筛选  13-38
  材料与方法  13-26
  结果  26-35
  讨论  35-37
  小结  37-38
第二部分 GA3、GA4和GA5与Tie2在体内及体外特异性结合试验  38-49
  材料与方法  38-40
  结果  40-46
  讨论  46-48
  小结  48-49
第三部分 GA3和GA5基因导入系统的构建及其转导报告基因的体内与体外靶向导入试验  49-60
  材料与方法  49-54
  结果  54-57
  讨论  57-59
  小结  59-60
第四部分 GA3和GA5基因导入系统转导p53基因的体内靶向性基因治疗试验  60-69
  材料与方法  60-63
  结果  63-67
  讨论  67-68
  小结  68-69
结论  69-70
参考文献  70-77
综述  77-86
附录  86-94
致谢  94-95

TIE2配体寡肽的设计、筛选及其在基因治疗中的靶向导入作用

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