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红藻氨酸对大鼠海马p38MAPK活性及海马神经细胞形态和电生理的影响

作　者: 刘智良
导　师: 徐如祥
学　校: 第一军医大学
专　业: 神经外科学
关键词: 癫痫红藻氨酸原子力显微镜 Fos GFAP ERK P38MAPK JNK SB203580兴奋性突触后电位抑制性突触后电位
分类号: R742.1
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

背景：海马硬化和星形胶质细胞增生是人类颞叶癫痫的重要神经病理学特征之一，而致痫后星形胶质细胞反应的机理目前了解甚少。星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）内最重要的起支持、营养和保护作用的细胞，通过微环境对神经元的活动产生影响。神经胶质元纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）是星形胶质细胞特有的细胞骨架蛋白，其含量或结构的改变会引起相应星形胶质细胞在形态和功能上的变化，常被作为星形细胞活性状态的标志之一。癫痫发作时神经元高度兴奋，引起一系列细胞内反应。快速反应基因（即早基因,IEG）c-fos的蛋白产物Fos的表达可作为一种反映神经元兴奋和神经细胞功能活动的指标。如采用海马组织Fos和GFAP双重免疫组化染色技术，可以了解经侧脑室给予红藻氨酸微量注射致痫后星形胶质细胞和神经元的同步反应，有可能从组织形态学角度揭示致痫后神经元与神经胶质细胞之间的关系。癫痫发作可引起继发性神经细胞损伤甚至死亡，并且二者呈互为因果关系。信号转导参与细胞的损伤与死亡过程，而癫痫发作导致在体细胞损伤与死亡的信号转导机制目前知之甚少。新近认为丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）这种普遍存在的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶的信号通路是细胞外信号引起细胞核反应甚至导致细胞死亡的共同通路，主要包括细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK）、p38 MAPK激酶、c-Jun氨基末端蛋白激酶（c-Jun N-terminal protein kinase，JNK）、ERK₅。细胞死亡涉及ERK通路的抑制和p38 MAPK、JNK通路的激活，然而致痫后海马中这些激酶活性变化规律还不清楚。癫痫发作后的MAPKs活性变化规律和作用途径可采用Westem一blot方法来进行研究。癫痈发作一这种最强刺激之一可以引起神经细胞蛋白酪氨酸残基的磷酸化而激活p38 MAPK。而p38 MAPK与应激反应和细胞死亡有关，P38 MAPK有可能经激活中性白细胞产生自由基和释放弹性蛋白酶而产生神经毒性作用，从而介导神经细胞死亡。新近己发现用p38 MAPK特异性抑制剂SBZ仍580阻断p38 MApK的激活可显著减少外伤后神经细胞的死亡，但由此是否可对癫痈发作所引起神经细胞的损害也产生保护作用还不清楚。因此，本研究拟采用对在体海马组织神经细胞与离体培养海马细胞两种水平的神经细胞经KA作用后进行形态学观察可能在一定程度上来阐明上述假说。癫痈的本质是神经元异常兴奋，而谷氨酸是中枢神经系统最重要的兴奋性神经递质。哺乳动物中枢神经系统中，离子型谷氨酸（i Glu）受体有三种亚型:N一methyl一D一asPartio acid困MDA)、a一amino一3^hydroxy一5一methyl一4-isoxazolepropionie aeid（AN于A）和kainate（KA）受体。其中，目前对NMDA和A侧IPA的研究己较深入。目前己公认，KA受体的激活可以对海马产生致痈作用。因此，研究KA致痈后电生理过程有助于理解KA致痈的电生理机制。虽然已经肯定KA通过激活海马的KA受体，可使神经元产生高度兴奋性而导致癫痈，然而KA受体广泛分布于海马神经元的突触前和突触后膜，以往由于缺乏高度选择性激动剂和拮抗剂阻碍了对KA受体的进一步研究，对其致痈的电生理机制尚不清楚。新近已出现cNQx这种KA抑制剂，加上bicuculhne、strychinine和AP一5来分别封闭KA、GABA、甘氨酸和NMDA受体介导突触电流。通过不同的钳制电位，借助膜片钳的技术手段就分别可以获得兴奋性突触后电流（EPSCs）和抑制性突触后电流（IPSCs）。目的: 1.研究KA致痈后大鼠海马神经元兴奋和星形胶质细胞反应的变化; 2.研究KA致痈后大鼠海马MAPKs（ERK，p38 MAPK，州K）活性的变化规律; 3.研究阻断p38 MAPK的激活，对KA致痈后大鼠海马神经细胞可能具有的保护性作用及机制; 一5-4.研究阻断p38 MApK的激活，对KA作用后的培养大鼠海马神经元可能具有的保护性作用及机制;5.研究KA作用对大鼠海马脑片CAI区突触递质的影响及机制。本实验分五部分探讨红藻氨酸致痛大鼠海马p38M连pK活性变化及对海马神经细胞结构和电生理的影响第一部分红藻氨酸致痛后大鼠海马神经元和星形胶质细胞的反应性变化及机制以往认为星形胶质细胞（astrocyte，AsT）仅仅起支持、营养和保护作用，对癫痈的研究主要以神经元作为出发点，而对动物致痈后脑组织AST变化的研究甚少。本实验采用右侧脑室立体定向微量注射红藻氨酸（kaha。acid，KA）癫痈大鼠模型，采用Fos和GFAP免疫组织化学染色方法，在海马切片上动态同步观察反应神经元和星形胶质细胞的数量和形态的变化。方法: 1·SD雄性大鼠50只，体重200士209，随机分为3组:①实验组（n=36），分别设致痛后30min、lh、Zh、6h、12h和24h共6个时间点，每个时间点6只;②假手术组（n=12），取相同时间点，每个时间点2只;③正常组（n=2）。 2.实验组以右侧脑室立体定向微量注射KA（0 .05%，溶于生理盐水）3川制作癫?

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缩写词中英文对照表  5-8
中文摘要  8-19
英文摘要  19-34
研究背景及目的  34-40
第一部分红藻氨酸致痫后大鼠海马神经元和星形胶质细胞的反应性变化及机制  40-57
  材料与方法  41-48
  结果  48-52
  讨论  52-56
  小结  56-57
第二部分红藻氨酸致痫后大鼠海马组织ERK、p38 MAPK和JNK的活性变化  57-74
  材料与方法  59-69
  结果  69-70
  讨论  70-73
  小结  73-74
第三部分抑制p38 MAPK信号通路对癫痫发作引起海马神经细胞损伤的保护作用及机制  74-86
  材料与方法  75-80
  结果  80-82
  讨论  82-85
  小结  85-86
第四部分抑制p38 MAPK信号通路对海马神经元毒性损伤的保护作用及机制  86-101
  材料与方法  87-94
  结果  94-96
  讨论  96-100
  小结  100-101
第五部分红藻氨酸对海马CA1区突触传递的作用及机制  101-111
  材料与方法  102-107
  结果  107-108
  讨论  108-110
  小结  110-111
全文结论  111-112
参考文献  112-120
综述1: 点燃效应癫痫动物模型研究状况及评价  120-126
综述2: 神经胶质细胞及与癫痫的关系  126-133
综述3: MAPKs信号转导及与癫痫的关系  133-140
致谢  140-142
在读期间撰写和发表的论文  142-146
附图  146-176

红藻氨酸对大鼠海马p38MAPK活性及海马神经细胞形态和电生理的影响

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