学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

作用于电压门控钠通道的蜘蛛毒素的结构与功能研究

作　者: 肖玉成
导　师: 梁宋平
学　校: 湖南师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 蜘蛛毒素抑制剂胱氨酸结模体钠通道膜片钳
分类号: Q51
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
下　载: 203次
引　用: 8次
阅　读: 论文下载

内容摘要

虎纹捕鸟蛛（Selenocosmia huwena Wang [=Orni thoctonus huwena（Wang）]）、海南捕鸟蛛（Selenocosmia hainana Liang[=Ornithoctonus hainana（Liang）]）和雷氏大疣蛛（Macrothele raveni）是在我国南方发现的具有很强毒性的蜘蛛新种，其粗毒能使昆虫和小型脊椎动物致死。本项研究采用膜片钳技术在NG108-15细胞上首先检验了这三种蜘蛛的粗毒对电压门控钠通道和延迟整流钾通道的影响。结果表明，三种蜘蛛粗毒对外向延迟整流钾通道没有明显作用，但对TTX敏感型钠通道表现出较强的浓度依从性抑制效应，半有效抑制浓度(IC₅₀)分别为：3.4、1.8和11.0mg／L。值得注意的是，三种粗毒抑制钠通道的方式均与其它已知蜘蛛钠通道毒素不同，都不能影响通道的激活与失活时间，表明在这些蜘蛛粗毒中极有可能含有未曾报导过的新型钠通道毒素。通过阳离子交换和反相高效液相色谱柱层析（HPLC），进一步从海南捕鸟蛛粗毒中分离获得了一种新的神经毒素，命名为海南捕鸟蛛毒素-Ⅴ（hainantoxin-Ⅴ，HNTX-Ⅴ）。同时还利用膜片钳或双电极杆电压钳技术鉴定了该毒素以及其它三种海南捕鸟蛛毒素（包括海南捕鸟蛛毒素-Ⅰ（HNTX-Ⅰ）、海南捕鸟蛛毒素-Ⅲ（HNTX-Ⅲ）和海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ（HNTX-Ⅳ））对离子通道的影响特征。四种海南捕鸟蛛毒素均是多肽类钠通道毒素，由33或35个氨基酸残基组成，其中6个Cys以Ⅰ-Ⅳ、Ⅱ-Ⅴ、Ⅲ-Ⅵ的方式配对形成3对二硫键。HNTX-Ⅴ是HNTX-Ⅳ的一种天然突变体，两者之间只有一个残基（Ser20Ala）不同。三维结构测定和同源模建结果表明四者都属于抑制剂胱氨酸结（ICK）模体蛋白家族。四种HNTX均能抑制TTX敏感型钠通道的激活，但不影响TTX不敏感型钠通道。HNTX对TTX敏感型钠通道亚型的选择性不一样。HNTX Ⅲ-Ⅴ能完全抑制大鼠背根神经节（DRG）细胞TTX敏感型钠通道，IC₅₀分别是1.1、44.6和46.8 nM。但HNTX-Ⅰ对DRG细胞钠通道无影响，却能抑制不表达于DRG细胞上的rNa_v1.2／β1和昆虫钠通道para／tipE（外源表达于非洲爪蟾卵母细胞上），IC₅₀分别是68.0和4.3μM。HNTX Ⅲ-Ⅴ还能使DRG细胞TTX敏感型钠通道的稳态失活曲线向超极化方向漂移约10 mV。同粗毒水平实验结果一样，中英文摘要四利，}一六以都不能延缓钠通道的失活时间，也没有漂移电压一「包流（l一V）狡系曲线。特别是HNTX一工H和HNTX一IV（1 pM）还能完全阻断位点3毒素枷K{（.类。一蝎毒素，来自于东亚钳蝎But力:Is二rtensz’ Karsch粗毒）延缓的失活电流，表明海南捕鸟蛛毒素不是位点3毒素，其影响钠通道的机制应该有别于6一atraCotoxinS和协一agatoXinS等蜘蛛毒素。我们进步推测HNTX在钠通道上的结合位点是位点l。通过固相化学合成的方法，将日NTX一丁v进行了四个点位突变（Ser12Ala、Arg26Ala、LyS27Ala和八以29A}的。其‘一1，，突变体LyS27Ala和Arg29Ala抑制钠通道的能力只有天然毒素的1/100，而Arg26Ala和serlZAla与天然毒素相差不大，证明}”一“和八r厂’应该是海南捕鸟蛛毒素结合钠通道的关键残基。敬车l}缨毛蛛（凸ilobl妞‘加￡j’z’n那为、）是最近在我国海南省发现的，蜘蛛新种。通过阳离子交换和/或反相HPLC，我们从其粗毒中得到了两种一丰度较高的组分，并命名为敬钊缨毛蛛毒素一I（JZTX一I）和敬钊缨毛蛛一心索一日l（二仪Tx一工H）。MALD工一TOF质谱鉴定和Edman降解测序结果表明:、!/下X一I的分子量为3675.6 Da，含有33个氨基酸残基;而JZTX一工H的分广员为:份1 9.4 Da，含有36个残基。两毒素中均包含6个CyS。结合TCIi尸部分还原修饰、氨基酸序列测定和多酶酶解分析法等技术，鉴定出这6个C、、能够形成3对二硫键，连接方式均为卜工V、工工一V、工工卜V工。我们还采川〔、l）X八末端快速扩增（RACE）法获得了它们的CDNA序列，并由此推测出、J/’f\一l和健限可工I的前体分别含有62和63个氨基酸残基。经分析发现!Z拭11!前体中含有一不常见的蛋白酶酶切位点（一X一Ser一），而不是丫八:、g一，_且其间隔蛋白区序列只含有5个残基，是目前蜘蛛毒素前体‘扫员脚的·个。!漠片钳实验结果表明JZTX一I和JZTX一IH都是电压门控钠通迈，扮素，子{!对钠通道亲和力与亚型的选择性不一致。JzTX江是日前首次报道的一源于蜘蛛粗毒的类Q一毒素，能抑制棉铃虫幼虫神经元细胞钠通道、少、鼠D既细胞‘I’TX敏感型钠通道和心肌细胞钠通道的快速失活，工C:‘，分别为8.86林M、0.99刚和31.6 nM，对三种细胞_<sub>匕钠电流的峰值大小都无明!IJ娜洲lJ，也不改变通道I一V曲线和稳态失活特征，但能加速D尺G细胞卜通道的火活恢复速率。而有意思的是，JZTX一IH在粗毒中可能存在异构现象，因为在分离过程，}，，该毒素具有两个不同的吸收峰，_且彼此功能明显不户丰丫尽，’i’{:两种‘!Z‘fX一工H都能选择性地作用于心肌细胞竹X不敏感’(口钠通中英文摘要道，但一者为抑制电流的快速失活相，与JZTX一工类似;而另一者为抑制电流激活，10刚几乎可以完全抑制位点3毒素引起的电流失活部分。IC印分别为12.8哪和0.38哪。我们进一步推测:JZTX一工和JZTX一工H（抑制通道失活）应该是位点3毒素，而JZTX一IH(抑制通?

全文目录

中文摘要  3-6
英文摘要  6-12
第一章钠离子通道及其毒素研究进展  12-41
  1.1 钠通道  13-22
  1.2 电压门控钠通道毒素  22-31
  1.3 电压钳和膜片钳在钠通道和钠通道毒素中的应用  31-39
  1.4 本课题研究的背景和意义  39-41
第二章细胞急性分离与传代培养  41-51
  2.1 NG108-15细胞(neuroblastoma×glioma cell)  41-44
  2.2 背根神经节细胞(dorsal root ganglia)  44-46
  2.3 心肌细胞(cardiac myocytes)  46-47
  2.4 卵母细胞(oocyte)  47-49
  2.5 昆虫神经元细胞(insect neurons)  49-51
第三章三种蜘蛛粗毒的毒理活性比较  51-63
  3.1 前言  51-52
  3.2 材料与方法  52-55
  3.3 结果与讨论  55-63
第四章海南捕鸟蛛钠通道毒素(HNTX-Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)的分离纯化及活性鉴定  63-98
  4.1 前言  63-64
  4.2 材料与方法  64-70
  4.3 结果  70-91
  4.4 讨论  91-98
第五章敬钊缨毛蛛毒素-Ⅰ和-Ⅲ的结构与功能研究  98-151
  5.1 前言  98-99
  5.2 材料与方法  99-111
  5.3 结果  111-141
  5.4 讨论  141-151
第六章主要研究结论与进一步研究设想  151-154
  6.1 主要研究结论  151-152
  6.2 进一步研究设想  152-154
参考文献  154-167
附录1  167-169
附录2  169-174
附录3  174-179
附录4  179-184
论文发表情况  184-185
致谢  185-186

作用于电压门控钠通道的蜘蛛毒素的结构与功能研究

内容摘要

全文目录

相似论文