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甘蓝型油菜生态型细胞质雄性不育两用系温度调控机理的初步研究

作　者: 袁美
导　师: 杨光圣；傅廷栋
学　校: 华中农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育生态型细胞质雄性不育两用系温度基因表达 Northern杂交
分类号: S565.4
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

细胞质雄性不育（CMS）是一种不能产生有活力花粉的遗传性状，这种现象在高等植物中普遍存在，其不育性的表现受核质两套遗传系统的控制，同时，有许多CMS的育性还受外界环境条件如温度、光照的影响。研究其发生机理有助于促进杂种优势利用和了解核质两套遗传系统相互作用规律。在目前油菜杂种优势利用中，pol CMS被认为是“第一个有实用价值的细胞质雄性不育类型”。大量的研究表明，orf224／atp6的表达与pol CMS有关，恢复基因Rfp在转录后水平上通过影响RNA加工来调控该区域的转录模式。本研究所用材料生态型雄性不育两用系（简称生态两用系）8-8112AB属于pol CMS类型，其在武汉秋播表现可育，在昆明或西宁夏播表现不育，其中温度是影响育性变化的主要环境因子。为正确认识和利用pol CMS生态雄性不育两用系提供实验依据，以及为进一步改良pol CMS生态雄性不育两用系提供理论参考，本文对调控8-8112AB育性变化规律的温度敏感基因遗传及其作用机理进行了初步研究，取得了如下主要结果： 1．研究在不同温度条件下生态两用系8-8112AB的花器官形态变化，主要结果表明，在相对低温条件下，8-8112AB与正常油菜品系1141B（pol CMS保持系）的花器官形态特征相似，而在相对高温条件下，则与pol CMS不育系1141A相同。 2．考查生态两用系8-8112AB及其F₁（1141A×8-8112AB）在不同播期、异地播种和人工生长箱控温条件下的育性表现，结果表明，在武汉秋播条件下，播期对8-8112AB及其F₁的育性变化影响不大，开花前5—10天的温度是影响育性变化的因子，即低温促进可育而高温导致不育，并且F₁的温度敏感性更强；在武汉春播和秭归、兰州夏播条件下，8-8112AB及其F₁均表现雄性不育；不同的温度处理对8-8112AB及其F₁的育性有明显的影响，在15℃/5℃时表现部分可育（育性4级），在25℃／15℃时表现雄性不育。 3．通过对1141A、8-8112AB及其F₁（114lA×8-8112AB）、F₂和BC₁（1141A×F₁）在武汉秋播和兰州夏播条件下育性表现的分析，认为8-8112AB细胞核内的温度敏感基因为不完全显性，且有数对微效温度敏感基因参与对温度的调控反应。 4．用10个线粒体基因探针对一套材料（包括正常胞质的可育系1141B，pol不育系1141A及其育性恢复系）的花蕾mtRNA进行了Northern检测，结果表明，只有3个探针atP‘、o嘴24和口嘴22检测到转录本的差异。atP‘在1 141B中只转录产生一个丰度很高的1 .IkbmRNA，在雄性不育的1141A和pol胞质的育性恢复株中这个转录本的丰度明显减少并出现了分子量较大的2个转录本2.2kb、1 .gkb mRNA。在pol胞质的育性恢复株中，与pol CMS不育株相比，2.2kb和1 .gkb转录本的丰度明显减少，并伴随着两个新的转录本1 .4kb和1.3kb。这表明本研究结果与前人的研究结果一致，即口榨24/atP‘是与pol CMs有关的区域，其转录受到恢复基因的调控。 5.口价24/atP‘在不同温度条件下的8一8 1 12AB花蕾中的差异转录受温度敏感基因的调控。在相对低温条件下，口嘴24/atP‘在部分可育的8一81 1 ZAB中转录产生2.2kb、1 .gkb、1 .4kb和1 .Ikb四个转录本，而在相对高温条件下，其在雄性不育的8一8112AB中的转录产物数目没有变化，但1.4kb转录本的丰度减弱。 6.在pol不育系（1 141A和8一8112AB）中，。嘴24/atP石在苗期和相对低温条件下的花蕾期具有相同的转录模式，共转录产生2.2kb、1.gkb、1.4kb和1.Ikb四个转录产物。 7.在114lA、114lB、8一sllZAB和8一8707中，o嘴24/atP‘在同一种材料不同花器官间（花柄、花曹、花瓣、雄蕊和雌蕊）的转录模式没有明显的差异。 8.用口夕24的特异引物扩增并克隆了。嘴24探针，该探针由口嘴24全序列的bp一81和bp一655间的序列组成。 9.从mtRNA转膜量、电泳时间长短、预杂交液和杂交液组成及洗膜条件等方面建立了适合本室条件的油菜Northem杂交的技术体系。最后，还对pol CMS与育性恢复机理和口榨24/atP‘表达与8一81 1 ZAB育性变化的关系等问题进行了讨论。

全文目录

中文摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
缩略语表  13-14
1 文献综述和开题设想  14-27
  1.1 引言  14
  1.2 油菜细胞质雄性不育的分类  14-16
    1.2.1 同源细胞质雄性不育  14-15
    1.2.2 异源细胞质雄性不育  15-16
  1.3 油菜细胞质雄性不育的分子生物学研究进展  16-23
    1.3.1 线粒体与CMS  16-17
    1.3.2 与CMS有关的线粒体基因或片段  17-19
    1.3.3 线粒体基因表达与CMS  19-21
    1.3.4 Rf与CMS  21-23
  1.4 温度与雄性不育  23-24
  1.5 开题设想和研究内容  24-27
2 材料和方法  27-37
  2.1 试验材料  27-28
    2.1.1 试验材料  27
    2.1.2 探针  27-28
  2.2 播期试验和温度处理及其育性调查  28-30
    2.2.1 播期试验  28
    2.2.2 温度处理  28-29
    2.2.3 育性调查  29-30
  2.3 Northern分析  30-33
    2.3.1 与RNA操作有关溶液和器皿的配制和处理  30-31
    2.3.2 mtRNA抽提及纯化  31
    2.3.3 mtRNA的电泳分离和Northern转移  31-32
    2.3.4 探针标记  32
    2.3.5 Northern杂交  32-33
    2.3.6 膜的重复再利用  33
  2.4 orf224探针的制备  33-35
    2.4.1 orf224特异片段的扩增  33-34
    2.4.2 大肠杆菌感受态细胞的制备  34
    2.4.3 目的片段与T载体的连接和转化  34-35
    2.4.4 克隆片段的鉴定  35
  2.5 探针的PCR制备  35-37
    2.5.1 探针的PCR扩增  35
    2.5.2 PCR产物纯化  35-36
    2.5.3 大片段探针的酶切回收  36-37
3 结果与分析  37-55
  3.1 生态两用系8-8112AB的温度敏感性及其遗传分析  37-42
    3.1.1 8-8112AB与1141A、1141B花器官形态的比较  37
    3.1.2 1141A、8-8112AB及其杂种F，分期播种的育性表现  37-40
    3.1.3 8-8112AB等材料在人工控温条件下的育性表现  40
    3.1.4 8-8112AB温敏基因的遗传  40-42
  3.2 细胞核基因对线粒体基因转录表达的影响讨论  42-55
    3.2.1 线粒体总RNA(mtRNA)的分离及检测  42-43
    3.2.2 Northern杂交体系的建立  43-44
    3.2.3 orf224探针的克隆与检测  44-45
    3.2.4 恢复基因Rf对orf224／atp6转录的影响  45-48
    3.2.5 温度敏感基因对ori224／atp6转录的影响  48-51
    3.2.6 orf224／atp6在不同组织和花器官中的表达  51-55
4 讨论和结论  55-60
  4.1 温度同8-8112AB育性变化的关系  55-56
  4.2 8-8112AB温度敏感基因的遗传  56-57
  4.3 有关pol细胞质雄性不育与育性恢复机理探讨  57
  4.4 orf224／atP6表达与8-8112AB育性变化的关系  57-59
  4.5 orf224／atp6在苗期和花蕾期的转录  59
  4.6 小结  59-60
参考文献  60-68
附录1 图版说明  68-69
附录2 图版Ⅰ  69-70
附录3 图版Ⅱ  70-71
附录4 图版Ⅲ  71-72
博士生简介  72-73
致谢  73

甘蓝型油菜生态型细胞质雄性不育两用系温度调控机理的初步研究

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