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荧光原位杂交和分子标记在水稻和小麦种质资源研究中的应用

作　者: 余舜武
导　师: 张端品
学　校: 华中农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 基因组原位杂交荧光原位杂交水稻类HAL2基因(RHL) P5CS基因水稻小粒野生稻疣粒野生稻小麦多花黑麦草体细胞杂种
分类号: S326
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

世界最主要的粮食作物都集中在禾本科作物上，如小麦，玉米和水稻。这些作物经长期的人工栽培和少数基因型品种的大面积推广，使这些农作物遗传资源越来越狭窄，受病虫和非生物逆境的危害越来越严重。为了解决世界人口的不断膨胀对粮食需求日益增大的问题，人们正在不断地挖掘野生物种的优良基因资源，不断地通过直向遗传方法将已克隆的基因在其它物种中进行利用。本研究为了了解禾本科作物中两个抗盐相关基因的比较遗传学特点，小麦和水稻与其野生种的杂种遗传学特点，以便充分利用抗盐相关基因和小麦与水稻的野生物种的优良种质资源，探索这些优异资源的使用方法，采用了荧光原位杂交（FISH）和其它遗传学方法进行了研究。 1．利用RHL cDNA克隆作探针，分别在水稻、玉米和大麦染色体上进行荧光原位杂交发现：RHL基因位于水稻第9染色体长臂上；在玉米中检测出2个位点，分别位于第2染色体长臂的近末端和第7染色体长臂近着丝粒处；在大麦中定位于第5染色体长臂末端。按照Gale和Devos 1998年发表在Science杂志中禾本科基因组环形图，发现被定位的玉米和大麦染色体均包含有水稻第9染色体的同源区，基本符合3个物种之间的基因秩序的共线性。但由于基因组大小不同、基因密度不一致以及微共线性保守性程度低，其在各自染色体位置上存在偏差。为了进一步证实RHL基因在玉米和大麦中的存在，通过Touchdown PCR方法扩增出长度一致为518bp的带。用生物素标记的荧光原位杂交技术，以豇豆（Vigna aconitfolilia）中克隆到的P5CS基因作探针对水稻进行物理作图。该探针大约位于水稻第9染色体的短臂近端点处，信号点距着丝粒的相对距离为51.79±1.24％。 2．栽培稻（Oryza sativa，AA，2n=2X=24）和小粒野生稻（O. minuta,BBCC,2n=4X=48）属间有性杂种以及栽培稻和疣粒野生稻（O.meyeriana,GG,2n=2X=24）属间有性杂种由陈葆棠博士提供，两个杂种通过胚抢救获得。通过形态学观察、染色体计数证实了栽培稻和小粒野生稻的杂种状态，进一步应用GISH通过不同的颜色明确地显示了F₁杂种中栽培稻和小粒野生稻来源的染色体。RAPD带型也清晰地揭示杂种中具有双亲的带型。稻瘟病接种实验发现杂种获得了小粒野生稻的部分抗性特点，其感病特点介于双亲之间。栽培稻和疣粒野生稻杂种染色体计数发现数目变化很大，分为两种情况，一种是24条，另一种是28～47条，后一种杂种植株占绝大部分。有丝分裂过程中，染色体先加倍成为四倍体，然后基因组部分分离可以解释该杂种混倍体形成的机制，整个过程类似于减数分裂第一次分裂。GISH结果显示能用两种颜色将杂种中的亲本染色体区分开来，丢失的染色体多半为栽培稻染色体，表明庆粒野生稻在杂种细胞中为优势细胞种。RAPD结果也显示杂种之间的带型差异很大，主要有两种情况，与染色体计数和GISH结果相吻合。结合GISH和RAPD带型统计，与栽培稻的亲缘关系而言，疵粒野生稻（GG）是一种比小粒野生稻（BBCC）更远缘的物种。 3.多花黑麦草作为一种野生牧草，具有许多小麦所不具有的抗病和其它特异优良性状。葛台明博士在1997年通过不对称融合获得小麦和多花黑麦草体细胞杂种。为了使黑麦草的优良险状能最终转移到小麦中，需要用小麦不断地回交以获得回交后代。体细胞杂种生长势差，生根困难，通过不断地使用生根培养基促进生根，然后移栽到大田中，利用不同播期的小麦花粉回交杂种，获得回交后代。通过有丝分裂中期染色体和减数分裂染色体行为观察，发现染色体数目低于预期值，不足42条，减数分裂过程中形成l⁴条单价体，第一次减数分裂后期，有落后染色体出现。为了了解细胞内染色体构成，GISH显示未发现黑麦草染色体的存在。AFLP结果显示体细胞杂种中黑麦草遗传物质相当少，只在少数几个杂种中检测到不超过2%的黑麦草带型，故体细胞杂种为胞质杂种。杂种染色体数目不足42主要是由于组织培养过程中染色体丢失造成的。

全文目录

中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
第一章文献综述  11-25
  1.1 荧光原位杂交研究进展  11-23
    1.1.1 FISH一般介绍  11-12
    1.1.2 FISH研究的靶染色体相  12-14
    1.1.3 FISH研究的探针标记  14-15
    1.1.4 提高FISH检测灵敏度策略  15-17
    1.1.5 基因组原位杂交的进展及其在植物中的应用  17-23
    1.1.6 小结  23
  1.2 主要的分子标记应用进展  23
  1.3 研究目的和意义  23-25
第二章两个耐盐基因的比较FISH作图  25-34
  2.1 植物耐盐基因研究进展  25-26
  2.2 RHL基因和豇豆P5CS基因研究概况  26-27
  2.3 材料与方法  27-29
    2.3.1 供试材料  27-28
    2.3.2 染色体玻片制备  28
    2.3.3 探针制备  28
    2.3.4 荧光原位杂交和图像分析  28-29
    2.3.5 PCR检测  29
  2.4 结果与分析  29-31
    2.4.1 关于RHL基因的研究结果  29-31
    2.4.2 关于P5CS基因的研究结果  31
  2.5 讨论  31-34
    2.5.1 染色体状态对FISH结果的影响  31-32
    2.5.2 RHL基因FISH作图在三种作物中的比较分析  32-33
    2.5.3 关于P5CS基因的讨论  33-34
第三章水稻远缘杂种一代研究  34-47
  3.1 材料与方法  37-38
    3.1.1 材料及材料处理  37
    3.1.2 染色体玻片制备  37
    3.1.3 总DNA抽提  37
    3.1.4 探针标记  37
    3.1.5 GISH及其荧光检测  37-38
    3.1.6 随机引物扩增DNA  38
    3.1.7 小粒野生稻杂种的水稻稻瘟病检测  38
  3.2 结果与分析  38-43
    3.2.1 栽培稻和小粒野生稻杂种  38-40
    3.2.2 栽培稻和疣粒野生稻杂种研究  40-43
  3.3 讨论  43-47
    3.3.1 染色体制片技术探讨  43
    3.3.2 基因组原位杂交技术的探讨  43-44
    3.3.3 染色体消除机制  44-45
    3.3.4 关于三个稻属的亲缘关系的探讨  45
    3.3.5 杂种植株的应用前景  45-47
第四章小麦与多花黑麦草体细胞杂种研究  47-60
  4.1 普通小麦的远缘杂交研究进展  47-48
  4.2 材料与方法  48-53
    4.2.1 供试材料  48
    4.2.2 繁苗继代培养基  48-49
    4.2.3 试管苗继代移栽、授粉及其回交后代的种植  49-50
    4.2.4 细胞学观察  50
    4.2.5 亲本再生植株及其后代总DNA的抽提  50
    4.2.6 杂种F1代的AFLP检测  50-53
    4.2.7 基因组原位杂交  53
  4.3 结果与分析  53-57
    4.3.1 试管苗繁殖  53
    4.3.2 花粉育性观察  53-54
    4.3.3 体细胞和花粉母细胞染色体观察  54
    4.3.4 AFLP鉴定  54-57
    4.3.5 基因组原位杂交鉴定  57
  4.4 讨论  57-60
    4.4.1 关于杂种一代的育性和形态学  57-58
    4.4.2 细胞遗传学研究  58-59
    4.4.3 关于AFLP结果的讨论  59-60
参考文献  60-74
附录  74-81
致谢  81-83
图版说明  83-94

荧光原位杂交和分子标记在水稻和小麦种质资源研究中的应用

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