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灵芝生物富硒及富硒灵芝硒蛋白的分离纯化和抗氧化性研究

作　者: 赵镭
导　师: 胡小松
学　校: 中国农业大学
专　业: 农产品加工及贮藏工程
关键词: 富硒灵芝子实体硒蛋白 EPR(顺磁共振自旋捕集技术) 微弱发光红细胞
分类号: TS20
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

灵芝是我国传统的药食珍品，硒则是人体的必需微量元素，以灵芝子实体进行生物富硒的研究，国外未有报导，国内也较少见而且尚待深入。因此，本实验对填补基础领域研究的空白、探索应用领域新的补硒资源和更有效的生物活性因子有着重要的意义。本论文的主要实验结果如下：培养基中硒的浓度为200～250μg／g时，可以获得产量及富硒量较为理想的富硒灵芝子实体；硒可以明显提高灵芝中多糖、蛋白质以及氨基酸的含量，但并不改变灵芝蛋白质的分布和蛋白质中氨基酸的组成配比；矿质元素中硒有极明显的增加，铜、钼等有一定量的增加，而铁、钙、锶等则有所下降。在富硒灵芝子实体中，80％以上的硒以有机硒形式存在，并主要以非硒代蛋氨酸（硒代半胱氨酸）的形式与蛋白质结合，其中水溶性蛋白和碱溶性蛋白是灵芝结合硒的主要蛋白，总结合硒量占蛋白硒的75％以上；此外，应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离富硒灵芝子实体中的含硒蛋白组分，并采用氢化物原子荧光法（HGAFS）测定蛋白或肽链条带中硒的含量，结果表明：在分辨出的13条蛋白条带中，分子量在8.709～142.53kDa的蛋白或肽链均结合了不同程度的硒，但硒主要分布在分子量不超过16kDa的蛋白或肽链中。富硒灵芝碱溶性蛋白的等电点初步确定在pH 4.2左右，抗氧化活性在60℃以下稳定，蛋白先经过葡聚糖凝胶（Sephadex G—100）分子筛层析，再进行强阴离子交换树脂（Biorad High Q）离子交换层析后，所获得的富硒灵芝含硒蛋白结合的硒量最高，每克蛋白含硒可高达5.48mg。顺磁共振自旋捕集技术（EPR）和CuSO₄-Phen-Vc-H₂O₂-DNA体系微弱发光法清除羟自由基（·OH）和超氧自由基（O₂^-·）的实验以及抗DNA损伤作用的研究发现，富硒灵芝蛋白和富硒灵芝多糖均具有较强地清除·OH和O₂^-·的活性，抗氧化作用强于对照—普通灵芝蛋白和普通灵芝多糖；硒与灵芝蛋白之间具有抗氧化协同作用，但硒与灵芝多糖以及灵芝蛋白与灵芝多糖之间则无此协同作用但却可以彼此增强抗氧化的活性；富硒灵芝蛋白为兼型抗氧化剂，能明显抑制和延迟DNA的氧化损伤发光，而且蛋白浓度与延迟时间之间存在着显著的线性依赖关系。此外，大鼠红细胞生物模型实验的结果表明，富硒灵芝蛋白能够剂量依赖性地抑制过氧化特丁烷（TBHP）引起的大鼠红细胞溶血、减少红细胞过氧化脂质产物—丙二醛（MDA）的生成，以及抑制高铁血红蛋白的产生和聚积，保护红细胞中的氧合血红蛋白免受氧化损伤。综上所述，富硒灵芝子实体是一种理想的补硒资源，其中主要赋存硒的灵芝蛋白更是灵芝中除多糖之外的另一种高生物活性因子，值得进一步深入研究和开发应用。

全文目录

第一章文献综述及立题分析  12-24
  1.1 灵芝生物学研究进展  12-15
    1.1.1 主要生物活性成分  12-13
    1.1.2 药理作用  13-15
  1.2 硒的生物化学及生理药理研究进展  15-20
    1.2.1 硒的生物大分子化合物  15-18
    1.2.2 硒的生化功能和对人体的作用  18-19
    1.2.3 人体硒的需要量  19
    1.2.4 硒的缺乏、补充与富硒食品的研究现状  19-20
  1.3 富硒灵芝的研究进展  20-21
    1.3.1 富硒灵芝的栽培  20-21
    1.3.2 性质研究  21
    1.3.3 功效学研究  21
  1.4 立题分析  21-22
  1.5 实验内容和设计  22-24
第二章灵芝富集硒对其产量及其主要营养成分的影响  24-34
  2.1 前言  24-25
  2.2 材料与方法  25-27
    2.2.1 仪器和试剂  25
    2.2.2 富硒灵芝子实体样品的来源及处理  25-27
  2.3 结果与讨论  27-33
    2.3.1 硒对灵芝子实体产量和硒富集能力的影响  27-28
    2.3.2 硒对灵芝多糖和灵芝蛋白含量的影响  28-30
    2.3.3 硒对灵芝蛋白和灵芝多糖结合硒能力的影响  30-31
    2.3.4 硒对灵芝蛋白分布的影响  31
    2.3.5 硒对灵芝蛋白中氨基酸构成的影响  31-32
    2.3.6 硒对灵芝矿物质组成的影响  32-33
  2.4 结论  33-34
第三章硒在富硒灵芝中的分布  34-45
  3.1 前言  34-36
    3.1.1 硒在微生物体内的代谢  34-36
    3.1.2 硒在富硒生物体中的赋存形态  36
  3.2 材料与方法  36-38
    3.2.1 材料及处理  36
    3.2.2 仪器和试剂  36-37
    3.2.3 实验方法  37-38
  3.3 结果与讨论  38-44
    3.3.1 富硒灵芝中硒的有机化程度  38-39
    3.3.2 富硒灵芝中有机硒的分布  39-40
    3.3.3 富硒灵芝中蛋白硒的分布  40-41
    3.3.4 富硒灵芝中含硒蛋白的分子量分布  41-42
    3.3.5 富硒灵芝蛋白中硒代氨基酸的分布  42-44
  3.4 结论  44-45
第四章富硒灵芝碱溶性含硒蛋白的分离纯化  45-58
  4.1 前言  45-48
    4.1.1 蛋白质分离纯化的方法  45-46
    4.1.2 硒蛋白分离纯化的方法  46-48
  4.2 材料与方法  48-50
    4.2.1 实验材料  48
    4.2.2 主要仪器和试剂  48
    4.2.3 实验方法  48-50
  4.3 结果与讨论  50-57
    4.3.1 富硒灵芝碱溶性蛋白等电点的初步确定  50
    4.3.2 富硒灵芝含硒蛋白的分离纯化  50-56
    4.3.3 富硒灵芝含硒蛋白清除自由基活性的热稳定性研究  56-57
  4.4 结论  57-58
第五章富硒灵芝抗氧化作用及机理的研究  58-80
  5.1 前言  58-60
    5.1.1 自由基的危害及分析研究  58
    5.1.2 富硒食品及灵芝清除自由基的研究  58-59
    5.1.3 CuSO_4-Phen-Vc-H_2O_2-DNA体系抗DNA损伤的研究  59-60
    5.1.4 抗红细胞氧化损伤作用的研究  60
  5.2 材料与方法  60-62
    5.2.1 主要仪器和试剂  60
    5.2.2 实验动物  60-61
    5.2.3 实验方法  61-62
  5.3 结果与讨论  62-79
    5.3.1 邻二氮菲-Fe~(2+)氧化法检测H_2O_2／Fe~(2+)产生的羟自由基  62-64
    5.3.2 微弱发光法抗DNA损伤作用研究  64-70
    5.3.3 顺磁共振自旋捕集技术(EPR)清除.OH和O_2~-.作用研究  70-76
    5.3.4 富硒灵芝蛋白对过氧化特丁烷引起的红细胞脂质过氧化损伤的抑制作用  76-79
  5.4 结论  79-80
全文总结与工作展望  80-83
参考文献  83-93
致谢  93-94
个人简历  94

灵芝生物富硒及富硒灵芝硒蛋白的分离纯化和抗氧化性研究

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