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液-固界面的吸附及溶菌酶在液相色谱中复性的应用研究

作　者: 王彦
导　师: 耿信笃
学　校: 西北大学
专　业: 分析化学
关键词: 液-固吸附 吸附量 溶剂浓度 Langmuir模型 复性 溶菌酶 构象 离子交换色谱 疏水色谱 排阻色谱
分类号: O657.72
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
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内容摘要


基因重组蛋白的复性问题是生物工程下游技术中的一个瓶颈。蛋白折叠色谱是近年来出现的一个新的复性方法，由于它能显著地改进复性产率，而且能将复性与分离纯化合为一步，降低下游成本，所以是当前生物技术中的一个研究热点。由于液相色谱中固定相与流动相之间的界面，即液-固界面对蛋白折叠起着至关重要的作用。所以本文将首先从描述液-固界面的模型入手，研究溶质在液-固界面的吸附行为受到的影响，在此基础上对变性蛋白在离子交换色谱(IEC)，疏水色谱(HIC)及排阻色谱(SEC)中的复性进行研究。 论文包括以下八个部分： 1．文献综述：界面吸附广泛存在于自然界中，而其中液-固吸附比气-固吸附要复杂的多和重要的多。本文对研究液-固吸附的意义及液-固吸附的特点、难点之所在，以及目前液-固吸附理论的研究进展进行了综述。蛋白折叠的研究具有重大的理论意义和重要的实际价值，目前的研究还一直处于经验摸索的阶段。本文从基本的热力学假说、动力学控制入手，提出了蛋白复性的基本策略，对在这些基本策略指引下发展出的各种复性方法及进展进行了全面地综述。共包括文献172篇。 2．以计量置换吸附理论(stoichiometric displacement theory for adsorption，SDT-A)为基础，从理论上首次推导出一个新的表征溶剂浓度对吸附量影响的吸附等温线。运用不同的假设条件和简化，得到了含有两参数，三参数和四参数的方程。两参数方程适用于溶质浓度非常低的情况，吸附量与溶剂浓度之间是一个线性的对数关系。三参数和四参数方程则适用于溶质浓度较大的情况，是一种非线性的对数关系。用芳香醇同系物在反相液相色谱(RPLC)中的前沿分析法进行了验证，新的方程都能很好的拟合实验数据。 3．以SDT为基础，首次从理论上推导出计量吸附理论中表征溶质对固定相亲合势大小的参数β_α值与流动相中强置换剂浓度的对数呈线性关系，并用苯的衍生物进行了实验验证，获得了满意的结果。而且，计量置换参数Z的分量是两个很有用的参数，但一直没有从RPLC中单独得到过，从新推导的这个吸附亲合势与溶剂浓度之间的方程式很容易得到Z的分量n和q值。从理论上首次将SDT-A和计量置换保留理论(stoichiometric displacement theory for retention， SDT一R)这两个分别表征吸附和保留过程的理论统一了起来，证明在SDT一R 中的容量因子的对数logk’与SDT一A中溶质对吸附剂亲合势的参数刀。之间存 在线性关系。从理论上推导出刀。值与溶剂浓度的对数作图收敛点的存在并阐 明了收敛点坐标的物理意义，与实验作图法得到的数据进行了对比，符合情 况很好。4.从气一固吸附体系中推导出的Langmuir方程，在气一固吸附中是一个定量的公 式，但近一世纪来只能经验性地描述组份在液相中的吸附。本研究以液一固界 面上的SDT为基础，考虑到液一固吸附体系中各组分之间的相互作用，首次从 理论上推导出了在液一固体系中描述在不同溶剂浓度条件下，溶质从溶液中吸 附的Langmuir公式，并称其为扩展的Langmuir公式。以不同溶剂浓度条件 下所得到的吸附等温线数据对理论推导出的扩展的Langmuir公式进行了验 证，与计量置换平衡中的参数相关联，表明用吸附等温线法计算的计量置换 参数Z与用高效液相色谱法得到的Z值符合程度很好.同时研究发现卵清蛋 白在疏水整体色谱柱的吸附与流动相中盐浓度有直接的关系。当蛋白在色谱 柱上保留时，在相同的溶质浓度条件下其吸附量的对数与置换剂水的摩尔浓 度对数之间有非常好的线性关系。5.以溶菌酶(切s)为目标蛋白，用紫外(UV)，荧光(FR)，RPLC，弱阳离子交换 色谱(WCX)及SDT中的Z值系统地研究了四种不同变性状态(肌变还原与 非还原，脉变还原与非还原)的切s的分子构象变化，并与其天然态进行了比 较.发现这四种不同变性状态的切s与天然态Lys的uv之间没有明显区别， 但与天然态相比，这四种变性态的场S的FR却都有红移现象.然而荧光光谱 并不能反映出这四种变性态以不同的变性方式所引起的分子构象变化.Lys在 RPLC和WCX的保留行为却能够反映出其还原变性态与非还原变性态之间 的差别，但仍不能显示出不同变性剂引起的蛋白分子的构象变化.只有液一固 界面上SDT中的参数Z值才能反映出上述所有的差别.还引入了变性度和相 对变性度的概念以定量地方式表征在不同变性环境中切s分子构象变化的程 度。6.首次用Hlc复性了还原变性的琢S。研究了还原变性琢S在三种疏水性不同 的HIC柱上的复性情况。发现其在疏水性最弱的XDM一GMI型色谱柱的复性 效率最高，蛋白浓度为2.omg/mL时可以达到90%以上，但在更高的蛋白浓度时其复性效率显著降低。发现在疏水性更弱的WCX柱上，还原变性切s的保留呈现离子交换和疏水双保留机理。研究了还原变性切s在此wcx柱用疏水模式复性的情况，发现在这种WCX柱上用疏水和离子交换双梯度进行复性可以明显地提高其复性效率，当蛋白浓度达到17.2m酬mL时，活性回收率达到80%。同时考察了流动相组成，脉

全文目录


第一章 文献综述  16-47
  1.1 研究液-固吸附理论的意义  16-17
  1.2 液-固吸附的特点  17-18
  1.3 吸附等温线的研究  18-19
    1.3.1 Langmuir模型  18
    1.3.2 Freundlich模型  18-19
    1.3.3 计量置换模型  19
  1.4 研究蛋白复性的意义  19-21
    1.4.1 理论意义  19-20
    1.4.2 实际意义  20-21
  1.5 蛋白质的变性  21-22
  1.6 蛋白质复性的原理  22-26
    1.6.1 热力学的假说  22
    1.6.2 动力学的控制  22-24
    1.6.3 蛋白多肽链折叠中间体  24-25
    1.6.4 蛋白质折叠中二硫键的形成  25
    1.6.5 脯氨酸异构化是蛋白质折叠的限速步骤  25-26
  1.7 促进蛋白质体外折叠的策略  26-27
    1.7.1 以变性蛋白的重折叠作为研究体外折叠的模型  26
    1.7.2 蛋白折叠的策略  26-27
  1.8 蛋白质复性方法及目前的进展  27-35
    1.8.1 传统的复性方法  27-28
    1.8.2 稀释添加剂法  28-29
    1.8.3 分子伴侣及人工分子伴侣  29-31
    1.8.4 折叠色谱法  31-35
  1.9 二硫键的正确对接  35-37
  1.10 溶菌酶复性的研究  37-40
  1.11 本研究的目的和意义  40-42
  参考文献  42-47
第二章 吸附量与溶剂浓度间的定量关系  47-59
  2.1 前言  47-48
  2.2 理论部分  48-50
    2.2.1 当a_(P(?)_nD_((m-q))很小时，a_(P(?)_nD_((m-q))/aSD近似等于0  49
    2.2.2 当a_(P(?)_nD_((m-q))较小但a_(P(?)_nD_((m-q))/aSD≠0时  49-50
  2.3 实验部分  50-51
    2.3.1 仪器  50
    2.3.2 主要试剂  50
    2.3.3 实验方法  50-51
  2.4 结果与讨论  51-57
    2.4.1 两参数方程的线性关系的验证  51-52
    2.4.2 两参数方程预测结果的比较  52-53
    2.4.3 两参数方程lna_(P(?)_nD_((m-q))对ln aD作图收敛趋势的研究  53-54
    2.4.4 两参数方程在溶质浓度很低和较高时获得参数值及相关系数的比较  54-55
    2.4.5 多参数方程的回归得到的参数值及相关系数  55-56
    2.4.6 在相对高的溶质浓度下实验结果和预测值之间的比较  56-57
  2.5 结论  57-58
  参考文献  58-59
第三章 液-固吸附体系组份对固定相的亲和势β_α与体相组成间的定量关系  59-77
  3.1 前言  59-60
  3.2 理论  60-62
    3.2.1 β_α测定的基础  60
    3.2.2 β_α与溶剂浓度之间关系的理论推导  60-61
    3.2.3 β_α与logα_D关系的验证  61-62
    3.2.4 Z的分量  62
  3.3 实验部分  62-63
    3.3.1 仪器  62
    3.3.2 主要试剂  62-63
    3.3.3 实验方法  63
  3.4 结果与讨论  63-75
    3.4.1 吸附等温线的测定  63-66
    3.4.2 β_α与logα_D之间定量关系的验证  66-67
    3.4.3 比较用两种方法测得的n值  67-70
    3.4.4 参数n，q与同系物碳数之间的关系  70
    3.4.5 β_α对logα_D作图收敛点的物理意义的理论推导  70-71
    3.4.6 SDM-R方程中参数j,logφ  71-72
    3.4.7 SDT-A与SDT-R模型的统一  72-74
    3.4.8 β_α对logα_D作图收敛点坐标的理论值的验证  74-75
  3.5 结论  75-76
  参考文献  76-77
第四章 液-固吸附体系中扩展的Langmuir方程的推导和检验  77-99
  4.1 理论部分  77-84
    4.1.1 Freundlich公式-SDT-A吸附模型中的一种表达式  77-78
    4.1.2 SDM-R保留模型  78
    4.1.3 Langmuir模型  78-79
    4.1.4 扩展的Langmuir公式的推导  79-83
    4.1.5 扩展的Langmuir公式的验证  83
    4.1.6 参数b物理意义的考察  83
    4.1.7 参数α物理意义的考察  83-84
  4.2 实验部分  84-85
    4.2.1 仪器  84
    4.2.2 主要试剂  84
    4.2.3 实验方法  84-85
  4.3 结果与讨论  85-97
    4.3.1 吸附等温线的测定  85-86
    4.3.2 Langmuir公式扩展关系的验证  86-87
    4.3.3 扩展的Langmuir公式中参数的研究  87-91
    4.3.4 卵清蛋白在疏水整体色谱柱中吸附量与溶剂浓度间的关系  91-92
    4.3.5 选择卵清蛋白在整体色谱中合适的盐浓度  92-93
    4.3.6 卵清蛋白在不同盐浓度下吸附等温线的测定  93-94
    4.3.7 用Langmuir模型拟合卵清蛋白在疏水整体色谱柱上的吸附等温线  94-96
    4.3.8 卵清蛋白吸附量与溶剂浓度的关系  96-97
  4.4 结论  97-98
  参考文献  98-99
第五章 不同变性状态溶菌酶分子构象变化的研究  99-117
  5.1 基本原理  100-103
    5.1.1 RPLC  100-102
    5.1.2 IEC  102-103
  5.2 实验部分  103-106
    5.2.1 试剂与材料  103
    5.2.2 仪器  103-104
    5.2.3 lys的非还原变性  104
    5.2.4 lys的还原变性  104
    5.2.5 蛋白浓度的测定  104
    5.2.6 巯基含量测定  104-105
    5.2.7 紫外吸收光谱(UV)  105
    5.2.8 荧光光谱(FR)  105
    5.2.9 反相液相色谱(RPLC)  105
    5.2.10 弱阳离子交换色谱(WCX)  105
    5.2.11 Z和logI值的测定  105-106
  5.3 结果讨论  106-114
    5.3.1 不同变性状态下Lys的紫外吸收光谱  106-107
    5.3.2 不同变性状态下Lys的荧光光谱  107-108
    5.3.3 不同变性状态下Lys的RPLC  108-112
    5.3.4 不同变性状态下Lys的WCX  112-114
  5.4 结论  114-116
  参考文献  116-117
第六章 疏水色谱折叠还原变性的溶菌酶  117-143
  6.1 复性理论  117-119
    6.1.1 蛋白分子中的疏水作用力  117-118
    6.1.2 疏水色谱的折叠机理  118-119
  6.2 材料和方法  119-122
    6.2.1 材料  119-120
    6.2.2 装置  120
    6.2.3 还原变性Lys的制备  120
    6.2.4 色谱填料的制备  120
    6.2.5 容量因子的测定方法  120-121
    6.2.6 用疏水色谱复性还原变性的Lys  121
    6.2.7 稀释法  121
    6.2.8 分析方法  121-122
  6.3 结果与讨论  122-141
    6.3.1 含有不同浓度脲时还原变性蛋白在三种疏水柱上的复性情况  122-128
    6.3.2 蛋白浓度对还原变性Lys在PEG柱复性效率的影响  128-129
    6.3.3 离子交换色谱的双保留机理  129-131
    6.3.4 还原变性Lys在WCX柱上以HIC模式洗脱时脲浓度对其色谱行为的影响  131-132
    6.3.5 还原变性Lys在WCX柱上以HIC模式复性时脲浓度对复性效果的影响  132-136
    6.3.6 蛋白浓度对复性的影响  136-138
    6.3.7 动力学的影响  138-139
    6.3.8 流速的影响  139-140
    6.3.9 pH值的影响  140-141
  6.4 结论  141-142
  参考文献  142-143
第七章 离子交换色谱折叠还原变性溶菌酶  143-179
  7.1 材料和方法  143-146
    7.1.1 材料  143-144
    7.1.2 装置  144
    7.1.3 还原变性Lys的制备  144
    7.1.4 WCX填料的制备  144-145
    7.1.5 还原变性蛋白在不同脲浓度下的Z和logI值的测定  145
    7.1.6 用离子交换色谱复性还原变性的Lys  145-146
    7.1.7 稀释法  146
    7.1.8 分析方法  146
  7.2 结果与讨论  146-176
    7.2.1 流动相组成对于还原变性Lys在WCX上色谱行为及复性效率的影响  146-161
    7.2.2 Z和logI与活性回收率之间的关系  161-162
    7.2.3 蛋白浓度  162-163
    7.2.4 固定相的影响  163-168
    7.2.5 复性动力学研究  168-169
    7.2.6 流速对复性的影响  169-171
    7.2.7 pH值对复性的影响  171-172
    7.2.8 不同GSH/GSSG比例对复性的影响  172-174
    7.2.9 固定相与GSH/GSSG的协同作用对Lys复性的影响  174-176
  7.3 结论  176-177
  参考文献  177-179
第八章 排阻色谱法折叠还原变性溶菌酶  179-192
  8.1 凝胶过滤复性原理  179-182
  8.2 材料和方法  182-184
    8.2.1 材料  182
    8.2.2 装置  182
    8.2.3 还原变性Lys的制备  182-183
    8.2.4 凝胶过滤色谱柱的制备  183
    8.2.5 用凝胶过滤复性还原变性的Lys  183
    8.2.6 分析方法  183-184
  8.3 结果与讨论  184-190
    8.3.1 SEC与IEC复性动力学的比较  184-187
    8.3.2 脲梯度流速对复性的影响  187-190
  8.4 结论  190-191
  参考文献  191-192
论文发表情况  192-194
致谢  194

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