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小金海棠和香橙耐缺铁机理研究

作　者: 李凌
导　师: 李道高；周泽扬；裴炎
学　校: 西南农业大学
专　业: 果树学
关键词: 小金海棠（M.xiaojinensis Cheng et Jiang）丽江山荆子（M.rockii Schneid.）香橙（C.junos （Sieb.）Tanaka）枳（P.trifoliata（L.）Raf.）缺铁胁迫缺铁失绿土壤pH H~+分泌茎尖培养三价铁螯和物还原酶（FCR）三价铁螯和物还原酶基因（FRO2） mRNA Northern杂交组织印迹空间表达模式
分类号: Q945.78
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

碱性及钙质土壤上粮食作物和果树的缺铁现象在世界范围内普遍存在。铁在土壤中尽管含量很丰富，但通常都呈不溶状态很难被植物吸收。据统计，全球约25％～30％的土壤存在潜在的植物缺铁现象。植物缺铁，叶片脉间失绿，叶肉发黄甚至变白，叶片缩小，如果缺铁症状严重，会引起生长停滞甚至死亡，给农业生产造成严重损失。果树作为一种与人民生活密切相关的重要经济作物，由于其本身的特点，缺铁造成的产量损失远比一年生作物严重，因为果树一旦栽培在土壤中便很多年不移动，所以有明显的缺铁积累效应。可是，时至今日缺铁现象还没有完全被人们认识清楚，现行的矫治措施也收效不大，有些甚至还带来严重的环境问题。随着分子生物学和现代生物技术手段的发展，科学家们开始寻找新的方法来解决缺铁问题，创造铁吸收利用高效型的植物种类已经成为一条有希望的途径，在果树生产中，创造新的综合性状优良同时又耐缺铁的砧木便可以达到既防治果树缺铁又保护环境的目的。基于此，本研究选择了两种果树砧木，小金海棠和香橙因为它们在初步的田间鉴定中表现耐缺铁，但它们耐缺铁的生理及分子机制并不清楚。本研究通过进一步分析香橙和小金海棠的耐缺铁特性，研究它们耐缺铁的生理原因和分子基础，并通过分析三价铁螯合物还原酶基因的空间表达模式，从分子水平上去探讨植物耐缺铁的原因，为从香橙和小金海棠中克隆三价铁螯合物还原酶基因奠定基础，并为人工创造耐缺铁的果树砧木提供基础研究数据。主要的研究结果如下： 1：铁胁迫下香橙的生理反应研究香橙在田间实验中表现耐缺铁，在pH7.8的土壤中生长正常，叶片无任何缺铁症状；但对照植物枳在同样土壤条件下却表现出明显的缺铁症状，作为缺铁程度指标的叶片叶绿素含量极显著低于香橙。枳在缺铁营养液中培养4周即可出现明显缺铁症状，而生长在同样时间内和同样缺铁培养液中的香橙观察不到任何缺铁症状，香橙的叶片叶绿素和活性铁含量均极显著高于枳；但枳的黄化叶片的总铁含量高于香橙和枳的绿色叶片。恰如以前的许多报道，铁是唯一的组织含量和缺铁程度没有相关关系的个例。香橙的根系H”分泌迅速被缺铁激活，在缺铁4天即明显强于对照处理，在缺铁12周依然明显强于对照处理；积的幼苗根系在缺铁4天时也有较强的H” 分泌，但随着缺铁时间的延长，在缺铁12周时H”分泌已观察不到。由于培养液以NO厂析为N源，它会引起溶液PH的升高，但香橙的培养液在加入Fe卜， Fey和完全无 Fe 3种处理下的 pH升高的值始终低于积 3种处理的培养液的升高值。涨醚和积的 3种处理的溶液的 eH增加的值始终是＋Fey｝＋Feh ）Fe。很显然，缺铁激活了香橙根系净H”的分泌，使得香橙控制环境PH的能力始终比积强，香橙根系很强的H”分泌能力与香橙耐缺铁的特性有关。香橙根系的三价铁赘合物还原酶活性被缺铁诱导强烈增加，在缺铁4周时酶活性增加了20倍；积在缺铁4周时酶活性仅增强了不到3倍。。很明显，香橙根系三价铁赘合物还原酶活性的强烈增加与香橙耐缺铁的特性直接相关。香橙比积耐缺铁的原因便是铁胁迫条件下，香橙根系三价铁螫合物还原酶恬性被缺铁诱导增加的幅度远大于积的酶活性增加幅度。香橙根系三价铁赘合物还原酶的还原区域与H”分泌区域重叠；而且被缺铁激活的香橙根系H”分泌先于根系三价铁赘合物还原酶的出现。可见，增强的H“ 分泌可以降低根际土壤的PH，低的根际土壤PH不仅增加了根际土壤中铁的溶解度，而且为根系三价铁螫合物还原酶的活动提供了适宜的PH环境，因为已经发现该酶有PH依赖性，碱性PH会强烈地抑制该酶活性。缺铁使香橙根系的形态发生了一定的变化。开始，香橙幼苗的根系生长比积慢，但随着铁胁迫时间的延长，积的地上部分生长受到明显抑制，根系生长减缓，根长而纤细，很少侧根发生；而香橙的根系则变的粗短，缺铁胁迫下的香橙的根长和恻根的发生量虽明显低于对照处理，但侧根发生量却明显优于积的缺铁处理，而根长又极显著低于积的缺铁处理。电子显微镜下观察到，与对照加铁处理相比，缺铁香橙的根吸收区域表皮细胞明显稻皱隆起；而积的根系吸收区域的表皮细胞在两种铁处理下没有明显变化。可见缺铁会使香橙的根系吸收区域发生一定的形态变化，沼皱隆起的细胞表面增加了吸收面积，对铁吸收无疑是有帮助的，但要肯定香橙的根系形态变化是香橙耐缺铁的原因之一尚需做进一步的较精确的测定。 2．铁胁迫下小金海棠的生理反应研究和小金诲棠无性系的建立小金海棠实生苗在田间土壤PH为7．8时生长正常?

全文目录

中文摘要  9-13
英文摘要  13-20
第一部分文献综述  20-45
  1．1 铁对生物体的作用  20-24
  1．2 铁在地壳中的存在状态及分布  24-28
  1．3 缺铁对植物造成的影响  28-33
  1．4 胁迫条件下铁的吸收机理和长距离运输  33-38
  1．5 植物缺铁的研究进展  38-41
  1．6 果树的铁营养问题  41-45
第二部分引言  45-49
  2．1 研究的目地意义  45
  2．2 实验设计和技术路线  45-48
  2．3 主要研究内容  48-49
第三部分香橙在铁胁迫下的生理反应研究  49-71
  3．1 材料与方法  49-52
    3．1．1 种子的萌发和幼苗的培养  49
    3．1．2 培养液的成分及用量  49-50
    3．1．3 根系质子分泌的测定  50
      3．1．3．1 用染色定位法测定根际的pH变化  50
      3．1．3．2 用pH计测定培养液pH变化  50
    3．1．4 根三价铁螯合物还原酶活力的测定  50-51
      3．1．4．1 酶活力染色定位测定法  50
      3．1．4．2 离体根三价铁螯合物还原酶活力的分光光度测定法  50-51
    3．1．5 根的形态变化研究  51
      3．1．5．1 根长度的测定  51
      3．1．5．2 根形态的电镜扫描  51
    3．1．6 缺铁症状的调查  51
      3．1．6．1 砧木间症状的差异  51
      3．1．6．2 叶绿素含量的测定  51
    3．1．7 叶片的铁含量分析  51
    3．1．8 砧木田间症状的观察及土壤分析  51-52
  3．2 结果与分析  52-66
    3．2．1 田间状态下香橙和枳的表现  52-53
      3．2．1．1 田间土壤的pH和基本性状  52-53
      3．2．1．2 田间状态下香橙和枳的症状分析  53
      3．2．1．3 田间状态下香橙和枳的叶片叶绿素含量差异  53
    3．2．2 营养液培养的香橙和枳的表现  53-56
      3．2．2．1 香橙和枳缺铁症状的差异  53
      3．2．2．2 香橙和枳的叶片叶绿素含量的差异  53-55
      3．2．2．3 香橙和枳的叶片活性铁含量的差异  55-56
    3．2．3 营养液培养的香橙和枳根系H~-分泌的变化趋势和分泌区域定位  56-60
      3．2．3．1 根系H~-分泌的变化趋势和区域定位  56-58
      3．2．3．2 培养液的pH变化趋势  58-60
    3．2．4 根系FCR活性的时间变化曲线和还原区域的定位  60-64
      3．2．4．1 根系FCR还原区域定位  60-62
      3．2．4．2 FCR活力的时间变化曲线  62-63
      3．2．4．3 不同缺铁处理对FCR活力的影响  63-64
    3．2．5 缺铁胁迫下根的形态变化趋势  64-66
      3．2．5．1 缺铁胁迫下根的形态变化特点  64-65
      3．2．5．2 根吸收区域的电镜扫描  65-66
  3．3 讨论  66-70
    3．3．1 土壤pH与土壤可溶性铁  66-67
    3．3．2 关于根际pH的测定方法  67
    3．3．3 根系质子分泌能力与耐缺铁的关系  67-68
    3．3．4 关于根系ECR活力的测定方法  68
    3．3．5 根系FCR活力与耐缺铁的关系  68
    3．3．6 关于铁的含量问题  68-69
    3．3．7 缺铁诱导的形态变化与生理反应  69-70
  3．4 小结  70-71
第四部分小金海棠在铁胁迫下的生理反应研究及无性系的建立  71-84
  4．1 材料与方法  71-73
    4．1．1 小金海棠和丽江山荆子实生苗的准备  71
    4．1．2 小金海棠和丽江山荆子的嫁接实验  71-72
    4．1．3 小金海棠和丽江山荆子的营养液培养  72
    4．1．4 小金海棠和丽江山荆子叶片叶绿素含量的测定  72
    4．1．5 小金海棠和丽江山荆子根系质子分泌测定  72
    4．1．6 小金海棠和丽江山荆子根系FCR活力染色定位测定  72
    4．1．7 小金海棠和丽江山荆子叶片FCR活力染色定位测定  72
    4．1．8 小金海棠无性系的建立  72-73
      4．1．8．1 培养基  72
      4．1．8．2 无菌材料的获得  72-73
      4．1．8．3 小金海棠的培养条件  73
      4．1．8．4 增殖培养  73
      4．1．8．5 生根培养  73
      4．1．8．5 移栽  73
  4．2 结果与讨论  73-82
    4．2．1 小金海棠和丽江山荆子实生苗在田间的生长状况  73
    4．2．2 小金海棠砧和丽江山荆子砧上的接穗生长状况  73-76
    4．2．3 小金海棠砧和丽江山荆子砧上的接穗叶片叶绿素含量  76-77
    4．2．4 小金海棠和丽江山荆子根系的质子分泌比较  77-78
    4．2．5 小金海棠和丽江山荆子根系的FCR活性差异  78-80
    4．2．6 小金海棠和丽江山荆子叶片FCR活性差异  80
    4．2．7 无性系的建立  80-82
      4．2．7．1 试管苗的增殖  80-81
      4．2．7．2 不同培养基和激素水平对试管苗生长的影响  81
      4．2．7．3 生根与移栽  81-82
  4．3 小结  82-84
第五部分铁胁迫下香橙和小金海棠三价铁螯合物还原酶基因的表达研究  84-97
  5．1 材料与方法  84-86
    5．1．1 材料的处理与取样的时间  84
    5．1．2 探针的制做与标记  84-85
    5．1．3 标记效率的检测  85
    5．1．4 组织印迹  85-86
    5．1．5 组织印迹的Northern杂交  86
  5．2 结果与分析  86-92
    5．2．1 质粒的提取与酶切  86-87
    5．2．2 探针的标记与标记效率的检测  87
    5．2．3 香橙和枳各营养器官的组织印迹mRNA Northern杂交  87-89
    5．2．4 小金海棠和丽江山荆子各营养器官的组织印迹mRNA Northern杂交  89-91
    5．2．5 FRO2-like表达的种间差异  91
    5．2．6 FRO2-like表达的空间特点  91-92
  5．3 讨论  92-96
    5．3．1 FCR在植物根中的分布  92
    5．3．2 FCR在根以外的营养器官中的分布及铁跨细胞膜的运输  92-93
    5．3．3 酶活性的调控  93
    5．3．4 铁长距离运输中FCR作用  93-95
    5．3．5 组织印迹杂交在木本植物基因表达研究中的应用  95
    5．3．6 关于探针的标记方法  95-96
  5．4 小结  96-97
第六部分总结  97-101
参考文献  101-111
附录一文中缩写词  111-112
附录二已克隆的真核生物铁吸收转运系统相关基因  112-113
作者简介  113-114
学习期间撰写和发表的论文  114-115
致谢  115-116

小金海棠和香橙耐缺铁机理研究

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