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抗黄矮病小麦易位系基因组TAC和cDNA文库的构建及筛选的研究

作　者: 王晓萍
导　师: 辛志勇；张增艳
学　校: 中国农业科学院
专　业: 作物遗传育种
关键词: 小麦黄矮病抗性可转化人工染色体 cDNA 文库
分类号: S512.1
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

利用抗黄矮病小麦—中间偃麦草易位系HW642的细胞核DNA构建了1个可转化人工染色体(transformation-competent artificial chromosome，TAC)文库。文库由2.3×10~6克隆构成，重组率为90.48％，平均插入片段大小为22kb左右，约覆盖普通小麦单倍体基因组2.5倍，在该文库中分离得到单拷贝DNA序列的概率是95.77％。文库保存在24块96孔板中，每个孔中约含有1000个不同的重组克隆，采用Pooled PCR的方法对文库进行筛选。对HW642一周龄幼苗接种饲黄矮病毒蚜虫，接种48h后取幼叶提取mRNA构建了一个cDNA文库，文库的滴度为1.5×10~6pfu/ml。随机挑取103个重组克隆，用限制内切酶EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ消化，统计分析结果表明插入片段在150～4000bp之间，平均插入片段大小为2000bp左右，重组率为95.15％。用来源于小麦7DL的简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)引物wms37扩增中间偃麦草、抗病易位系及感病材料，得到1条与抗性共分离的特异条带，约450bp。将此特异标记条带转化为SCAR(sequence characterized amplified region)标记，命名为SC-W37，用于筛选HW642基因组TAC文库，得到12个阳性克隆，对阳性克隆进行了PCR-Southern验证。分别以中间偃麦草、中国春基因组总DNA为探针与限制酶HindⅢ消化后的阳性克隆做反向Southern杂交，有2个克隆在杂交信号强弱上表现差异，但五种限制内切酶的RFLP分析结果没有找到中间偃麦草特异的多态性片段。以SC-W37在中间偃麦草中的扩增产物作为探针筛选所构建的HW642 cDNA文库，得到2个阳性克隆。其中1个具有完整的开放读码框，长度为822bp，编码273个氨基酸。经NCBI分析同源性和EMBL分析结构特征，该蛋白序列与已发表的防卫反应基因抑制素(prohibitin)氨基酸序列有很高的同源性，与植物的抑制素序列的同源性为82.28％：与酵母的抑制素序列同源性为90.07％；与人和鼠的抑制素序列同源性为82.27％，并有其明显的结构特征。Southern杂交结果表明该基因为单拷贝序列，来源于小麦，可以作为小麦的抑制素候选基因，因此把它命名为w-ph。Northern杂交结果说明，该基因为低丰度组成型表达。根据w-ph两端序列设计引物扩增HW642、两个不同来源的中间偃麦草及感病亲本中8601基因组DNA，得到2～5条扩增带。以w-ph作为探针进行PCR-Southern杂交分析，在HW642中得到1条与阳性对照大小相同的杂交带，说明w-ph基因是缺少内含子的；而在中间偃麦草和中8601各有1条约1.8kb的杂交信号，说明在它们的基因组中也存在着Wph的同源序列。另1个阳性克隆长度为1050hp 为1不完整的核昔酸编码框，具有抗水解酶2归bhydrolase二）的同源序列，命名为 w心bh，在基因组中为中低拷贝序列，在BYDV和冷诱导后表现低丰度组成型表达。LA－PCR扩增产物的Southern杂交结果说明w－abh作为一个基因的一部分也是缺少内含子的。利用抗病基因类似物探针STI筛选HW642 cDNA文库得到二个阳性克隆a－7和Stl22，核昔酸长度分别为1095hp 和122fop，编码281 和305个氨基酸，分别与植物螫合素合成酶和紫酸磷酸酯酶具有较高的同源性。

全文目录

中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
第一部分引言  10-34
  1 植物抗病基因研究进展  10-28
    1．1 植物的抗病机制  10-12
    1．2 抗病基因的抗病机理  12-14
    1．3 已分离的植物抗病基因及特点  14-17
    1．4 植物抗病基因克隆的方法  17-19
    1．5 基因组文库的构建  19-24
    1．6 cDNA文库的发展和应用  24-28
  2 小麦黄矮病的研究进展  28-31
    2．1 小麦黄矮病的症状及发病气候条件  29
    2．2 黄矮病抗性基因的遗传规律  29
    2．3 黄矮病病毒的株系类型  29-30
    2．4 小麦黄矮病抗源  30-31
  3 立题意义及技术路线  31-34
    3．1 立题意义  31-33
    3．2 技术路线  33-34
第二部分研究报告  34-91
  第一章小麦黄矮病抗性基因特异分子标记SC-W37的获得  34-44
    1 材料与方法  35-39
      1．1 材料  35
      1．2 方法  35-39
    2 结果  39-41
      2．1 小麦SSR引物wms37的扩增  39
      2．2 特异扩增带wms37-_（450）的克隆和鉴定  39-40
      2．3 序列测定  40
      2．4 引物SC-W37的重新设计和扩增  40-41
    3 讨论  41-44
  第二章抗黄矮病小麦-中间偃麦草易位系基因组可转化人工染色体（TAC）文库的构建及筛选  44-58
    1 材料和方法  44-49
      1．1 材料  44
      1．2 方法  44-49
    2 结果  49-55
      2．1 HW642基因组原位杂交  49-50
      2．2 HW642部分酶切测试  50
      2．3 HW642基因组TAC文库  50-51
      2．4 Pooled PCR的筛选  51-52
      2．5 PCR-Southern分析  52-53
      2．6 TAC阳性克隆的酶切  53
      2．7 TAC阳性克隆与中间偃麦草和中国春基因组总DNA杂交  53-54
      2．8 阳性克隆TAC-2与TAC-11的RFLP分析  54-55
    3 讨论  55-58
  第三章抗黄矮病小麦-中间偃麦草易位系cDNA文库的构建及筛选  58-91
    1 材料和方法  58-70
      1．1 材料  58
      1．2 方法  58-70
    2 结果  70-87
      2．1 HW642总RNA的提取  70-71
      2．2 cDNA文库的构建  71
      2．3 小麦抑制素候选基因w-ph的克隆  71-77
      2．4 w-ph的Southern杂交分析  77
      2．5 w-ph的转录分析  77-78
      2．6 w-ph LA-PCR的扩增  78
      2．7 w-abh的克隆  78-80
      2．8 w-abh的Southern杂交分析  80
      2．9 w-abh的转录分析  80-81
      2．10 w-abh的LA-PCR扩增  81
      2．11 利用抗病基因类似物探针ST1筛选HW642 cDNA文库  81-87
    3 讨论  87-91
全文结论  91-93
参考文献  93-109
致谢  109-110
作者简历  110

抗黄矮病小麦易位系基因组TAC和cDNA文库的构建及筛选的研究

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