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霍乱肠毒素B亚单位在转基因番茄植物中表达的研究

作　者: 彭志强
导　师: 俞守义
学　校: 第一军医大学
专　业: 病原生物学
关键词: 霍乱肠毒素B亚单位番茄转基因植物基因表达
分类号: R378.3
类　型: 博士论文
年　份: 2001年
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内容摘要

本论文研究的目的是利用转基因植物的技术，获得能正确表达霍乱肠毒素B亚单位（CTB）的番茄，并希望制成在生食后能刺激粘膜免疫系统产生保护性抗体的疫苗。目前许多先进国家的研究机构及工业界，积极研究开发转基因植物作为生物反应器，欲取代传统的微生物及酵母发酵系统，来生产具有高价值的医用蛋白质。此外，利用植物种子生产的外源基因工程蛋白质的品质相当稳定，可降低储藏及运输的费用。在某些用途下，例如作为饲料添加剂，或食品及酿酒的原料，或口服疫苗等，若含有外源蛋白质的组织可直接食用的话，则不需要经过高成本的纯化过程；为了利用植物系统表达细菌抗原蛋白，希望制成可食用的蔬果疫苗用于预防感染性腹泻病。选用番茄作为表达系统是因为它是世界上最重要的果蔬之一，具有营养成分丰富，适口性强，生、熟食均可的特点，且它的遗传转化系统相对较为成熟，为此，我们设计将霍乱肠毒素B亚单位（CT-B）基因转入番茄（L.esculentum,金丰一号）中表达，通过大量预试验建立了有效的番茄外源基因转化系统，并成功将CT-B基因转入番茄细胞中，获得了转基因植株，ELISA检测和Western杂交试验的结果表明CT-B基因在番茄中获得表达。首先利用高保真PCR、分子克隆、计算机分析和序列分析等方法构建了2个中间载体（pRCTB、pRCTBK）和4个植物双元表达载体（pGA-CTB、pGA-CTBK、pBI_CTB、pBI-CTBK），其中pRCTBK、pGA-CTBK、pBI-CTBK载体的CT-B基因的3’加上内质网引导序列SEKDEL，均以CaMV35S为启动子，NOS终止子，并将其中2个植物表达载体（pBI-CTB和pBI-CTBK）通过电转化法直接转入根癌农杆菌LBA4404。高效的再生及转化系统是外源目的基因导入植物的前提，本研究采用叶盘法，需要考虑外植体的来源及种类、供体菌株、培养筛选条件等因素。在对番茄的遗传转化试验中发现：1）对于番茄离体子叶培养，单加细胞分裂素（玉米素ZT或6-苄氨基嘌呤BA）对不定芽的分化均有效，但ZT的效果更好，ZT彭志强博士论文：霍乱肠毒素 B亚单位在番茄植物中表达的研究不仅能提研叶的再生频率，也s蹦加分化的牙数。2）加入少量生长素后，对不定芽的分化有明显的抑制作用。3）适宜于鹏体组织培养的外植体并不一定适宜于做转基因受体jZE）ytl＆的多地｝植体中，以二o子叶处切害仔喻产生吸K动本用作转化受体最好。4归濒同顿统以MSO为基坷时柒帛基，附加 ZTI．h吗几和 IAA．2叫吓 10—13天酗的子咐敝，娜再生频率达97．5％，每叶吵植体平均再姐敝39个。5）番茄子叶的高频转化系统是以高频再生系统为基础，子叶预培养2天，根癌农杆菌侵染30州，暗处AIA＋g 2 M，A：muurnllHt85EjjgxHHHIMstKx，）B＝um．l－－－…化出芽。句探索了最佳的选择压强度和砌p时间即p霉素浓度为扣叫札，————，％——。对I3 ＄M：1！EfnskrelW－因组DNA，颗PCR和Southrm A4qiKi的方法，证实10株显示CTB基因整治侄幡浓隆因组DNA中。提取含 q和 pBICIBK Mh随因翻删片的总的可靴蛋白，进行ELISA栅仰WH杂交，娥表明C7J3在番茄植物中得到正确表达，表达量达 30ugh叶片和 4flirt叶片，含内质网引导序列SEKDEL的植物表达载体表达量略高。至此，洲门得到了表达霍乱肠毒素B亚单位的番茄植株。对植物表达扶原基因CTS的应用前景及在植物中表达所存在的问题进行了详细的讨论。番茄中的表达量相对较低，我什认为其原因是多方面的，虽然二者的表达系绞铆属于植物，但由于所采用的种或品种的不同，表达量存在差异是可以预见的；另外也可脚困娜1的纯化技术有关，从植物中提取的粗蛋白可sggjt＆ffl；5＋的0七或者使部分CPS发生了降解。当然，不同植物表达载体的应用以及各种调控D启动子，增强子的不同，也膨）源蛋白的表达量出现差异，这在目前尚无一致的标准，进一步力0强对各表纹羹系统分子生物学基础研究是必段的。将其它抗原基因与CTS基因同时构建到植物表达载体 — —－时中，通过对转基因植物的基因表达、产物的免疫原性和Iftipe．－xxxu－－的进一步研究，有可敝喊免疫效果更好的可食用蔬果疫苗，从而渡愧阶、使用方便、安全有效的目的。在试验过程中，对一些分于生物学试验方法进行了改进，如提高PCR产物亚克隆效率方活根癌农杆茵中重组质粒的提取及酶切证实方法的改进。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-8
缩略词表  8-9
第一部分：前言  9-17
  1．1 植物基因工程的发展  9-10
  1．2 可食用植物疫苗的研究进展  10-12
  1．3 预防感染性腹泻植物疫苗的研究概况  12-15
  1．4 本论文的目的意义及主要内容  15-17
第二部分：含CTB基因植物表达载体的构建  17-32
  2．1 材料和方法  17-25
  2．2 结果与分析  25-30
  2．3 讨论  30-32
第三部分： CTB基因在番茄中的转化与整合  32-60
  3．1 材料和方法  32-34
  3．2 结果与分析  34-41
  3．4 讨论  41-44
  第四部分： CTB基因在番茄中表达的检测  44-60
    4．1 材料和方法  44-53
    4．2 结果与分析  53-57
    4．3 讨论  57-60
结论  60-61
主要参考文献  61-70
附图  70-73
附录1 CTB基因（cDNA）核苷酸序列  73-74
附录2 相关质粒图谱  74-76
附录3 文献综述：  76-93
  1．预防感染性腹泻的可食用疫苗的研究进展  76-82
  2．转基因植物表达重组蛋白的研究进展  82-93
附录4 攻读学位期间发表的论文情况  93-94
后记  94-95

霍乱肠毒素B亚单位在转基因番茄植物中表达的研究

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