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乳酸孔球菌表达口服弓形虫基因疫苗的研究

作　者: 杨秋林
导　师: 陆惠民；黄伟达
学　校: 苏州大学
专　业: 病原生物学
关键词: 弓形虫乳酸乳球菌口服基因疫苗弓形虫表面蛋白P30 （P30）弓形虫棒状体蛋白1（ROP1）
分类号: R392-33
类　型: 博士论文
年　份: 2001年
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引　用: 3次
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内容摘要

目的：构建弓形虫昆山分离株和RH株速殖子期表达的基因的完整长度cDNA文库，从中筛选保护性抗原基因，导入乳酸乳球菌进行表达，制备弓形虫口服基因疫苗，免疫小鼠，观察其抗攻击感染的保护力。方法：用CF-11纤维素柱快速提纯速殖子，以盐酸异硫氰酸胍（AGPC）一步法抽提总RNA，oligo-dT纤维素分离mRNA后，用ClonTech公司的Smart^TMPCR cDNA文库构建试剂盒，构建了弓形虫昆山分离株和RH株的表达型文库。采用聚合酶链反应（PCR）从cDNA文库中扩增得到编码P30和ROP1的基因，经DNA序列分析后导入表达载体pGEX-5x-3，然后在大肠杆菌BL21中进行表达。用亲和层析柱纯化表达产物，并以SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。从构建好的质粒psk-P30中以BamHI和XhoⅠ双酶切出P30基因，以相同的酶切位点导入psk-PsT质粒，再以PvuⅡ将Ps-P30-T切出，以相同的酶切位点导入大肠杆菌-等酸乳球菌穿梭表达质粒L2-PTRK而构建成L2-PsP30T质粒。用BamHI和XhoⅠ从构建好的psk-ROP1中切出ROP1再以相同的酶切位点导入L2-PsP30T而构建成L2-PsROP1T。电转化感受态乳酸乳球菌，以Western blotting分别鉴定P30和ROP1在乳酸乳球菌中的表达。大量发酵制备口服疫苗，并且通过口服方法免疫BALB/c小鼠。经过4周7次口服后，用约100个弓形虫RH株速殖子攻击感染已经口服法免疫的BALB/c小鼠，观察其抗攻击感染的保护力，并检测细胞因子IL-4、INF-γ水平的动态变化。结果：1.构建成弓形虫昆山分离株和国际标准株RH株cDNA文库，分别获得5×10⁶（昆山分离株）和5×10⁵（RH株）个独立克隆，重组率均为99％，插入片段的平均长度均约为1kb。2.获得弓形虫昆山分离株的P30基因和RH株的ROP1基因，并证明昆山分离株的P30基因与RH株的P30基因之间只有两个碱基不同。我们得到的RH株的ROP1基因在Ossorio报道的基因的447位与448位之间有一96bp的插入片段，另有14个碱基不同，造成3个氨基酸的改变。两基因之间有91.19％的同源性。3.在大肠杆菌乳臣扎球苗表达口用弓形虫基因疫苗的研究中文摘要表达P30基因时得到一分子量为54ica的融合蛋白，占大肠杆菌总蛋白的38％。在大肠杆菌表达MI基因时得到一分子量约为7IkDa的融合蛋白。4．P3 0 ＄因和ROPI基因在乳酸乳球菌中的表达产物中分别有一约30ica、43 ica的蛋白带能被弓形虫病人血清识别 5．P30组其平均寿命为 14．25天，ROPI组其平均寿命 7．75天，P30加 ROPI组其平均寿命7．5天，空质粒对照组为8．5天，生理盐水对照组为8天。与对照组相比，免疫组的eF4的水平升高，而h4的水平降低。结论：l本文库可望用于弓形虫疫苗研究的候选基因的筛选。2．得了一与OSS。i。报道的基因有较大差异的ROP基因。3分别在大肠杆菌中得到了P30融合蛋白和ROPI融合蛋白的高效表达。4．在乳酸乳球菌中得到了P30蛋白和 ROP蛋白的微量表达。5．通过口服法进行乳酸乳球菌活菌表达的弓形虫基因疫苗免疫是一种有希望的抵抗弓形虫的方法。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-8
序言  8-11
论文正文  11-41
  第一部分弓形虫的分离与纯化  11-13
  第二部分弓形虫速殖子期表达型cDNA文库的构建  13-18
  第三部分 P30基因和ROP1基因的克隆及其分别在大肠杆菌中的表达  18-29
  第四部分 P30基因和ROP1基因在乳酸乳球菌中的表达  29-35
  第五部分乳酸乳球菌表达口服弓形虫疫苗的免疫效果观察  35-41
结论  41-43
参考文献  43-45
综述  45-55
攻读学位期间公开发表的论文  55-56
附录  56-69
致谢  69

乳酸孔球菌表达口服弓形虫基因疫苗的研究

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