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神经退行性疾病相关蛋白的翻译后修饰对蛋白功能影响的研究

作　者: 费尔康
导　师: 王光辉
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 神经生物学
关键词: 神经退行性疾病 蛋白质翻译后修饰 家族型肌肉萎缩侧索硬化症 铜锌过氧化物歧化酶 SUMO化 脊髓小脑共济失调III型/马查多-约瑟夫病 ataxin-3 肝糖原合成酶激酶 磷酸化
分类号: R741
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


神经退行性疾病是一类由脑中特定区域神经元发生退变而引起的慢性进行性神经系统疾病,通常可分为家族遗传型和散发型,在家族遗传型中,主要由于致病基因的突变而引起发病。大部分神经退行性疾病的一个共同的病理特征是致病蛋白会由于降解异常而在胞质、胞核或者胞外形成异常的积聚而形成聚集。约有20%的家族遗传型肌肉萎缩侧索硬化症（FALS）是由于编码铜-锌过氧化物歧化酶（SOD1）的基因发生突变而引起的,从而造成脑和脊髓运动神经元的选择性丧失引起发病。突变的SOD1通常在发病患者的脑和脊髓中通过聚集而形成包涵体,但其致病机制以及突变蛋白的聚集机制至今尚未能明确阐述。另一种神经退行性疾病脊髓小脑共济失调Ⅲ型（SCA3）/马查多-约瑟夫病（MJD）是由于编码谷氨酰胺的密码子CAG的数量在MJD1基因中非正常扩增而引起的一种常染色体显性遗传的多聚谷氨酰胺病。该病的主要病理特征为突变的ataxin-3（MJD1编码蛋白）在患者易感脑区内的神经元胞核内聚集形成包涵体,但其聚集机制以及致病机制至今也不清楚。神经退行性疾病中聚集的形成与这些致病蛋白的翻译后修饰作用有很大的关系。蛋白质的翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化和SUMO化等,它们可以通过调节底物蛋白的活性、亚细胞器定位、稳定性或者与其它蛋白质的相互作用而达到调节蛋白功能的作用。很多神经退行性疾病相关蛋白如huntingtin、ataxin-1、α-synuclein、DJ-1和tau等由于SUMO化修饰而对蛋白功能以及疾病发病过程产生影响,也有很多研究表明多聚谷氨酰胺疾病蛋白如huntingtin,ataxin-1和DRPLA的磷酸化对于蛋白的功能以及疾病发生有很重要的影响。因此,蛋白质的翻译后修饰作用与神经退行性疾病之间存在着很大的联系。本论文主要从家族型肌萎缩侧索硬化症（FALS）的致病蛋白SOD1的SUMO化和脊髓小脑共济失调Ⅲ型（SCA3）/马查多-约瑟夫病（MJD）致病蛋白ataxin-3的磷酸化这两方面来探讨蛋白质翻译后修饰对这些神经退行性疾病致病蛋白特性的影响,主要研究结果如下:1.我们运用免疫共沉淀方法和体外SUMO化反应,发现SOD1能够被SUMO-1修饰,但是却不能被SUMO-2和SUMO-3修饰。将SOD1中第75位赖氨酸这个保守的SUMO修饰位点突变为精氨酸后,SOD1则完全不能够被SUMO-1修饰。通过进一步的细胞共转染技术,并用荧光显微镜观察发现经SUMO-1修饰后,野生型和突变型SOD1所形成的胞浆内聚集均会增加,而且SUMO-1能够被招募至SOD1所形成的聚集上,与SOD1在细胞内聚集体上有共定位现象。更进一步通过加入放线菌酮（CHX）以抑制新生蛋白的合成来检测已合成蛋白的降解速度,证实SUMO-1可以稳定野生型和突变型SOD1而不易降解。这些结果提示,SUMO-1对SOD1在第75位赖氨酸的修饰可能参与调控SOD1的稳定性以及聚集的形成,进而可能对由SOD1突变所引起的FALS的发病产生影响。2.我们运用GST Pull-down和免疫共沉淀实验证实激酶GSK 3β与ataxin-3能够结合,并且通过γ-32P标记的ATP进行体外磷酸化实验证明正常和扩展的ataxin-3均能被激酶GSK 3β磷酸化。通过磷酸化位点的点突变实验,我们发现磷酸化的位点是在ataxin-3的第256位丝氨酸上。我们进一步构建了第256位丝氨酸丧失磷酸化的突变体S256A以及模拟磷酸化的突变体S256D,采用细胞转染和免疫印迹检测发现,扩展的ataxin-3的S256A突变体会形成高分子量的多聚体形成聚集,而没有突变的扩展的ataxin-3和其S256D突变体则只是单体。更进一步与分子伴侣Hsp40或Hsp70分别共转染后发现,Hsp70能够抑制扩展的ataxin-3的S256A突变体形成聚集。这些结果表明激酶GSK3β对ataxin-3第256位丝氨酸的磷酸化能够调节ataxin-3的聚集,该特性可能对SCA3/MJD的发病产生影响。通过以上两个方面的研究结果可以看出,蛋白质翻译后修饰作用能够调节神经退行性疾病致病蛋白的特性,影响蛋白的聚集,从而可能对于疾病的发病产生影响。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-11
缩略词  11-13
第一章 绪论(神经退行性疾病与蛋白质翻译后修饰)  13-33
  1.1 铜锌过氧化物歧化酶(SOD1)与家族型肌萎缩侧索硬化症(ALS)  13-18
    1.1.1 肌萎缩侧索硬化症(ALS)  13-15
    1.1.2 铜锌过氧化物歧化酶(SOD1)  15
    1.1.3 SOD1与FALS  15-18
  1.2 SUMO化修饰与神经退行性疾病  18-25
    1.2.1 SUMO蛋白家族  18-20
    1.2.2 SUMO结合与去结合  20-21
    1.2.3 SUMO化修饰的结果  21-23
    1.2.4 SUMO化作用与神经退行性疾病  23-25
  1.3 Ataxin-3与脊髓小脑共济失调Ⅲ型(SCA3)/马查多-约瑟夫病(MJD)  25-29
    1.3.1 SCA3/MJD概述  25
    1.3.2 Ataxin-3  25-29
    1.3.3 突变的ataxin-3与SCA3/MJD  29
  1.4 磷酸化以及肝糖原合成酶激酶3β(GSK 3β)与神经退行性疾病  29-33
    1.4.1 磷酸化与神经退行性疾病  29-31
    1.4.2 肝糖原合成酶激酶3β(GSK 3β)  31-32
    1.4.3 GSK 3β与神经退行性疾病  32-33
第二章 材料与方法  33-53
  2.1 细胞总RNA的提取及逆转录cDNA  33-34
  2.2 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)  34
  2.3 DNA样品的琼脂糖凝胶电泳  34-35
  2.4 从琼脂糖凝胶上回收DNA片段(TaKaRa Agrose Gel DNA Purification Kit)  35
  2.5 质粒DNA或DNA片段的限制内切性酶酶切  35
  2.6 DNA片段的连接反应(TaKaRa DNA Ligation Kit)  35-36
  2.7 大肠杆菌(JM109和BL21(DE3))化学感受态细胞的制备  36
  2.8 大肠杆菌感受态细胞的转化  36-37
  2.9 大肠杆菌质粒DAN小量抽提  37
  2.10 基于PCR的DNA定点突变  37-38
  2.11 本论文中所用质粒载体的构建  38-40
  2.12 大肠杆菌中蛋白质诱导表达  40-41
  2.13 蛋白质的SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)  41-43
  2.14 GST-Tag融合蛋白的小量纯化  43-44
  2.15 His-Tag融合蛋白的小量纯化  44
  2.16 经纯化所得到的蛋白溶液的脱盐与浓缩  44-45
  2.17 GST Pull-down  45
  2.18 体外SUMO化反应(In Vitro SUMOylation Assay)  45-46
  2.19 体外磷酸化反应(In vitro Phosphorylation Assay)  46-47
  2.20 Western Blot  47-48
  2.21 细胞培养  48-49
  2.22 细胞转染(脂质体转染法)  49
  2.23 细胞的裂解以及NP-40可溶性与不可溶性蛋白的分别收集  49-50
  2.24 免疫共沉淀(Co-immunocipitation,Co-IP)  50-51
  2.25 细胞的荧光观察以及蛋白聚集的定量  51-52
  2.26 蛋白降解实验  52-53
第三章 结果与讨论  53-73
  3.1 SUMO-1对人源SOD1的修饰促进其稳定性和聚集  53-63
    3.1.1 人源SOD1在HEK 293细胞内和体外均可被SUMO-1修饰  53-56
    3.1.2 SOD1第75位赖氨酸被SUMO-1修饰  56-57
    3.1.3 SUMO-2和SUMO-3不能修饰SOD1  57-58
    3.1.4 SOD1的SUMO化修饰促进SOD1聚集的形成  58-60
    3.1.5 SOD1的SUMO化修饰促进SOD1的稳定性  60-61
    3.1.6 讨论  61-63
  3.2 肝糖原合成酶激酶3β(GSK 3β)对ataxin-3第256位丝氨酸的磷酸化调节ataxin-3的聚集  63-71
    3.2.1 Ataxin-3与GSK 3β结合  63-65
    3.2.2 GSK 3β对ataxin-3第256位丝氨酸进行磷酸化  65-67
    3.2.3 扩展ataxin-3的S256A突变体在293细胞中是积聚成多聚化的,而且该多聚化可被Hsp70抑制  67-69
    3.2.4 讨论  69-71
  3.3 总结与展望  71-73
    3.3.1 总结  71-72
    3.3.2 展望  72-73
参考文献  73-83
致谢  83-85
攻读学位期间发表的学术论文与参加的学术会议  85

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学
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