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血管紧张素II在机械通气所致肺损伤中作用的实验研究

作　者: 冯丹
导　师: 姚尚龙
学　校: 华中科技大学
专　业: 麻醉学
关键词: 机械通气所致肺损伤 急性炎症反应 氧化应激 血管紧张素II 肾素血管紧张素系统 A549细胞 炎性细胞因子 洛沙坦
分类号: R563.8
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


第一部分机械通气所致肺损伤动物模型的建立目的建立大鼠机械通气所致肺损伤（VILI）动物模型,研究VILI病理生理改变及其可能的机制。方法40只雄性、健康的SD大鼠,体重在300-350g之间,随机均分成A、B、C、D四组,每组各10只。A组为空白对照组;B组为大潮气量通气1h组,潮气量（VT）=40 ml/kg;C组为大潮气量通气2h组,潮气量（VT）=40 ml/kg;D组为大潮气量通气4h组,潮气量（VT）=40 ml/kg。B、C、D组通气频率均为40次/分钟。实验结束后放血处死大鼠。光学显微镜下观测各组肺组织病理改变;RT-PCR检测大鼠肺组织中巨噬细胞炎症蛋白2（MIP-2）、细胞粘附分子（ICAM-1）、TNF-a以及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶亚单位p22phox等基因mRNA的表达水平;EMSA检测肺组织细胞NF-κB的活性,Western Blot检测肺细胞核内NF-κB p65蛋白表达水平;TUNEL法检测肺细胞的凋亡;同时检测肺湿干重比值、MPO、MDA、SOD;检测肺灌洗液中总蛋白浓度、白细胞计数、中性粒细胞计数的水平。结果（一）A组肺组织无明显病理改变;B组肺组织病理改变较明显,肺泡间隔增厚,肺泡腔内可见较多的炎性细胞,肺泡腔可见渗出物;C组肺组织病理改变加重,肺泡间隔增厚,肺泡腔浸润的炎性细胞明显增多,肺泡腔可见较多的渗出物,部分肺泡腔内有血性渗出液;D组肺组织病理改变明显加重,肺泡间隔明显增厚,肺泡腔中炎性细胞显著增多,肺泡腔中可见明显的血性渗出液。和A组相比,B、C、D组ALI评分均显著性增高（P<0.001）;和B组比较,C、D两组ALI评分显著性增高（P<0.01）;和C组比较,D组ALI评分显著性增高（P<0.01）。（二）和A组相比,B、C、D组湿干重（W/D）比值、MPO活性、总蛋白、白细胞计数、中性粒细胞计数、凋亡指数（AI）均显著性升高（P<0.01或0.001）;和B组相比,C、D组上述指标显著性升高（P<0.01或0.001）;和C组相比,D组上述指标值显著性升高（P<0.05或0.01或0.001）。（三）和A组相比,B、C、D组肺组织SOD值均显著性降低（P<0.05或0.01）;和B组相比,D组肺组织SOD值显著性降低（P<0.01）,而C组无显著性差别;和C组比较,D组肺组织SOD值显著性降低（P<0.05）。和A组比较,B、C、D组肺组织MDA含量显著性升高（P<0.01）;和B组比较,C组MDA含量无显著性差别,而D组显著性升高（P<0.01）;和C组比较,D组肺组织MDA含量显著性升高（P<0.01）。（四）A组MIP-2、ICAM-1、TNF-a、p22phox mRNA的表达水平较低, B、C、D组上述基因mRNA表达水平显著增高（P<0.01）;和B组比较,C、D组上述基因mRNA表达水平显著性增高（P<0.05或0.001）;和C组相比,D组上述基因mRNA表达水平显著性增高（P<0.05或0.001）。（五）和A组比较,B、C、D组NF-κB的活性显著性升高（p<0.01）;和B组比较,C、D组NF-κB的活性显著性升高（p<0.01）;和C组比较,D组NF-κB的活性显著性升高（p<0.05）。和A组比较,B、C、D组p65蛋白的表达显著性升高（p<0.01）;和B组比较,C、D组p65蛋白的表达显著性升高（p<0.01）;和C组比较,D组p65蛋白的表达显著性升高（p<0.05）。结论大潮气量机械通气产生了明显的急性肺损伤,表现为渗透性的肺水肿、白细胞浸润、急性炎症反应、氧化应激反应的激活以及广泛的肺细胞凋亡,其程度随着通气时间的延长而加重。第二部分机械通气所致肺损伤与肾素-血管紧张素系统的激活目的研究大鼠大潮气量机械通气所致肺损伤（VILI）时肾素-血管紧张素系统（RAS）的激活。方法本研究分成两部分。（一）24只健康雄性SD大鼠,体重在300-350g之间,随机分成B1、B2、B3、B4组（每组6只大鼠）。B1为空白对照组,不行机械通气;B2、B3、B4组分别行大潮气量机械通气（40ml/kg）,通气时间分别为1h、2h、4h。（二）24只健康雄性SD大鼠,体重在300-350g之间,随机分成C1、C2、C3、C4组（每组6只大鼠）。C1组为空白对照组,不行机械通气;C2、C3、C4组行机械通气,潮气量分别为8ml/kg、20ml/kg、40ml/kg,机械通气时间均为2h。实验结束后处死大鼠。光学显微镜下观测各组肺组织病理改变;光镜下行肺灌洗液中心粒细胞计数;化学比色法检测肺灌洗液总蛋白和肺组织中性粒细胞髓过氧化物酶（MPO）的水平,同时检测肺湿/干比（W/D）值;RT-PCR检测大鼠肺组织中血管紧张素原（ANG）、ANG II受体（AT1）以及血管紧张素转化酶（ACE）等基因mRNA的表达水平;Western Blot检测肺组织ACE的含量;ELISA法检测肺组织并检测肺组织中ANG II的含量。结果（一）B1组肺组织无明显病理改变,B2、B3、B4组出现急性炎性损伤性改变（同第一部分）,且随着通气时间的延长而逐渐加重。C1、C2组肺组织无明显病理改变, C3组出现急性炎性损伤性改变,C4急性炎性损伤性改变明显加重。和B1组相比,B2、B3、B4组ALI评分均显著性增高（P<0.001）;和B2组比较,B3、B4两组ALI评分显著性增高（P<0.01）;和B3组比较,B4组ALI评分显著性增高。和C1、C2组比较,C3、C4两组ALI评分显著性增高（P<0.01）;和C3组比较,C4组ALI评分显著性增高（P<0.01）。（二）B1组肺组织肺上皮细胞AT1受体仅有较弱的表达（免疫组化）,而B2、B3、B4组肺组织肺上皮细胞AT1受体表达显著性增多（P<0.01）,且随着通气时间的延长而显著增加（P<0.05或0.01）。C1、C2组肺组织肺上皮细胞AT1受体仅有较弱的表达,而C3、C4组AT1受体的表达水平显著性升高（P<0.01）;和C3组相比,C4组AT1受体的表达水平显著性升高（P<0.01）。（三）和B1组比较,B2、B3、B4组肺组织ANG II含量显著性增多;（P<0.01）;和B2组相比,B3、B4组ANG II水平显著性升高（P<0.05或0.01）;B4和B3组肺组织ANG II水平无显著性差别。C1、C2组肺组织ANG II水平无显著性差别,和C1、C2组相比,C3、C4组ANG II水平显著性升高（P<0.01）;和C3组相比,C4组AT1受体的表达水平显著性升高（P<0.05）。（四）和B1组比较,B2、B3、B4组ANG、AT1、ACE mRNA的表达水平显著性增高（P<0.05或0.01）,且随着机械通气的时间延长而显著增加（P<0.05或0.01）。C1、C2组肺组织ANG、AT1、ACE mRNA的表达水平无显著性差别,C3、C4组ANG、AT1、ACE mRNA的表达水平显著性增高（P<0.01）;和C3组比较,C4组ANG、AT1、ACE mRNA的表达水平显著性增高（P<0.05）。（五）和B1组比较,B2、B3、B4组肺组织ACE的含量显著性增高（P<0.01）,和B2组比较,B3、B4两组ACE的含量显著性增高（P<0.01）;和B3组比较,B4组ACE的含量显著性增高（P<0.01）。和C1组比较,C2组肺组织ACE的含量无显著性差别,C3、C4组ACE的含量显著性增高（P<0.01）;和C3组比较,C4组ACE的含量显著性增高（P<0.05）。结论大潮气量机械通气在产生急性肺损伤（VILI）的同时,导致RAS系统显著激活,肺组织血管紧张素II及其受体的表达显著增加,这可能是VILI的致病机制之一。第三部分血管紧张素II通过激活NF-κB上调A549细胞IL-8表达目的研究血管紧张素II对A549细胞核转录因子NF-κB和炎性细胞因子IL-8的影响。方法培养A549细胞,分别用10-6mmol/L浓度的人重组血管紧张素II刺激A549细胞0、1、2、4h（按刺激时间分为D1、D2、D3、D4组）。EMSA检测A549细胞核转录因子NF-κB的活性,Western Blot检测NF-κB p65的水平,RT-PCR检测IL-8 mRNA的表达水平。结果（一）EMSA检测各组肺组织NF-κB的活性和D1组相比,D2、D3、D4组NF-κB的活性显著性升高（P<0.01）;和D2组相比,D3、D4组NF-κB的活性显著性升高（P<0.01）;和D3组相比,D4组NF-κB的活性显著性升高（P<0.01）。（二）Western Blot检测NF-κB p65的水平和D1组相比,D2、D3、D4组NF-κB p65的水平显著性升高（P<0.01）;和D2组相比,D3、D4组NF-κB p65的水平显著性升高（P<0.05 or 0.01）;和D3组相比,D4组NF-κB的NF-κB p65的水平显著性升高（P<0.01）。（三）RT-PCR检测IL-8 mRNA的表达水平和D1组相比,D2、D3、D4组IL-8 mRNA的表达水平显著性升高（P<0.01）;和D2组相比,D3、D4组IL-8 mRNA的表达水平（P<0.05 or 0.01）;和D3组相比,D4组IL-8 mRNA的表达水平显著性升高（P<0.01）。结论血管紧张素II能显著激活A549细胞NF-κB系统并上调IL-8的表达,这可能是VILI的致病机制之一。第四部分血管紧张素II受体阻断剂对VILI的保护作用目的研究血管紧张素II受体（AT1型）阻断剂洛沙坦（Losartan）对机械通气所致肺损伤（VILI）的保护作用。方法40只健康SD大鼠,体质量300-350g ,随机均分成a、b、c、d四组,a组空白对照组,不行机械通气;b组为正常潮气量通气组:潮气量（VT）=10 ml/kg,呼吸频率（P）=40次/min;c组为大潮气量机械通气通气组:潮气量（VT）=40ml/kg,呼吸频率（P）=40次/min;d组为大潮气量机械通气通气加Losartan处理组:潮气量（VT）=40 ml/kg,呼吸频率（P）=40次/min,d组大鼠在实验前30min用Losartan溶液30mg/kg腹腔注射。实验结束后处死大鼠。检测各组肺组织病理改变,RT-PCR检测血管紧张素原、AT1受体mRNA的表达,ELISA法检测肺组织血管紧张素II的含量,EMSA、Western Blot检测肺组织核转录因子NF-κB的水平,TUNEL法检测肺细胞的凋亡,化学比色法检测肺组织丙二醛（MDA）的含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性,同时检测肺湿干重比值以及肺组织中性粒细胞髓过氧化物酶（MPO）的水平;对于肺灌洗液标本,具体检测肺灌洗液中总蛋白浓度、MIP-2以及白细胞计数的水平。结果（一） a、b组为正常肺组织病理图片;c组肺组织出现明显的炎性损伤性改变,肺泡间隔明显增厚,肺泡腔内可见较多的炎性细胞浸润,部分肺泡腔内有渗出液;和c组比较,d组肺组织病理改变明显减轻,肺泡间隔一定程度增厚,但轻于c组,肺泡腔可见少量炎性细胞浸润,部分肺泡腔有少量渗出物。（二）和a组比较,b组ANG、AT1 mRNA的表达水平无显著性差异（P>0.05）;和b组比较,c组ANG、AT1 mRNA的表达水平显著增高（P<0.01）。（三）a、b两组肺组织血管紧张素II的含量无显著性差异;和a、b组比较,c组肺组织血管紧张素II的含量显著性升高（P<0.01）。（四）和a、b组相比,c、d两组NF-κB的活性显著性升高（P<0.01）;和c组比较,d组NF-κB的活性显著性下降（P<0.05）;a、b两组NF-κB p65的水平无显著性差异。和a、b组相比,c、d两组NF-κB p65的水平显著性升高（P<0.01）;和c组比较,d组NF-κB p65的水平显著性下降（P<0.05）;a、b两组NF-κB p65的水平无显著性差异。（五）a、b组肺组织SOD含量无显著性差异;和a、b组相比,c组肺组织SOD含量显著性下降（P<0.01）;和c组相比,d组肺组织SOD含量显著升高（P<0.05）。a、b组肺组织MDA含量无显著性差别;和a、b组相比,c组肺组织MDA含量显著性升高（P<0.01）;和c组比较,d组肺组织MDA含量显著性下降（P<0.01）。（六）a组肺组织有少量肺细胞凋亡;和a组相比,b组肺组织细胞凋亡数目无显著性差异（P>0.05）;和a、b组相比,c组细胞凋亡数目显著性增加（P<0.01）;和c组相比,d组肺细胞凋亡数目显著性降低（P<0.01）。（七）和a、b组相比,c组肺灌洗液（肺组织）中总蛋白、白细胞计数、MPO、肺湿干重（W/D）比值、MIP-2、凋亡指数（AI）等指标显著性增高（P<0.01）;和c组比较,d组上述各项指标均显著性降低（P<0.05 or 0.01）;a、b两组上述各项指标无显著性差异。结论: VILI时肺组织血管紧张素II及其受体的表达显著增多,而血管紧张素II受体阻断剂Losartan能显著减轻VILI。

全文目录


英文缩略词表  6-7
中文摘要  7-13
英文摘要  13-19
前言  19-24
  参考文献  22-24
第一部分 机械通气所致肺损伤模型的建立  24-42
  材料与方法  24-29
  结果  29-37
  讨论  37-41
  参考文献  41-42
第二部分 机械通气所致肺损伤与肾素－血管紧张素系统的激活  42-63
  材料与方法  43-47
  结果  47-59
  讨论  59-62
  参考文献  62-63
第三部分 血管紧张素II通过激活NF-κB上调A549细胞IL-8表达  63-71
  材料与方法  63-66
  研究结果  66-68
  讨论  68-69
  参考文献  69-71
第四部分 血管紧张素II受体阻断剂对VILI的保护作用  71-84
  材料与方法  71-75
  结果  75-80
  讨论  80-82
  参考文献  82-84
全文总结与展望  84-86
综述  86-107
  综述一 机械通气所致肺损伤研究进展  86-100
  综述二 血管紧张素II 在急性肺损伤中的作用  100-107
攻读博士学位期间发表论文  107-108
致谢  108-109

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 呼吸系及胸部疾病 > 肺疾病 > 呼吸衰竭
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