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司帕沙星和恩诺沙星抗血清制备及其ELIAS分析应用

作　者: 刘兵
导　师: 屈凌波
学　校: 郑州大学
专　业: 药物分析学
关键词: 司帕沙星恩诺沙星多克隆抗体间接竞争酶联免疫吸附法药代动力学组织分布
分类号: R155.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

司帕沙星(SPFX)和恩诺沙星(ENR)均为氟喹诺酮类抗菌药,在我国作为临床用药和兽药而被广泛应用。随着近年来,SPFX和ENR应用时所产生的不良反应和耐药性的报道越来越多,为了药物使用的安全性,防止因用药不当而造成的不良后果,对体内药物进行实时监测是非常必要的。目前,体内药物分析的常用方法仍然是使用各种现代仪器进行分析。然而,在分析样品过程中,这些方法往往需要繁琐的样品前处理,造成实际样品的损失,而且,某些方法的灵敏度还不能达到药物在体内分析过程中的测定要求。因此研究出一种简便快速且灵敏的测定体内司帕沙星和恩诺沙星的方法,对临床用药具有非常好的指导意义,同时也为动物源性食品中的药物残留检测提供快速有效的方法。基于以上因素,本课题做了以下研究：1采用混合酸酐法将SPFX分别与载体蛋白(BSA和OVA)偶联,制备免疫抗原SPFX-BSA和包被抗原SPFX-OVA。分别经紫外光谱、红外光谱证明偶联的两种人工抗原偶联成功,并通过紫外光谱法计算出SPFX在各个蛋白质上的偶联数。通过皮下多点注射法免疫两只日本大耳白兔。首次免疫采用2 mg的SPFX-BSA溶于2mL生理盐水中,并与等体积的弗氏完全佐剂乳化后进行免疫,每隔10天加强免疫一次,最后一次免疫注射5天后,颈动脉取全血后的抗血清。通过ELISA检测得到的抗血清,效价达到1：102400。理想包被抗原的浓度为1μg/mL,抗血清的工作浓度为1：25600。优化条件后,得回归曲线y=-0.1636x+0.8881(R2=0.9942),检测范围为5 ng/ml-2μg/mL。抗血清与其他选择的喹诺酮类药物和非同类药物基本无交叉反应,说明本实验所制备的抗血清特异性强。为了考察ELISA方法的准确性,在牛奶、猪肉、小鼠血浆和小鼠尿液中的加样回收率分别为93.7%-110.3%、98.3%-104.9%、105.6%-113.3%和90.2%-98.1%。相对应的相对标准偏差为6.6%-10.6%、7.4%-19.5%、4.8%-8.2%和3.5%-9.6%。选择九个不同的浓度,进行ELISA方法和HPLC方法相关性的比较,得到回归方程为：y=1.0235x+0.1347(R2=0.9918),同时用两种方法检测司帕沙星片剂和胶囊中司帕沙星的含量,结果相似。说明两种检测方法具有较好的相关性。为了进一步扩大ELISA方法的使用范围,以大鼠为实验模型,探讨了司帕沙星的体内药代动力学过程,测得了司帕沙星药代动力学参数：AUCo-∞Tmax、Cmax分别为2.169 mghL+1、3h和346.06ng mL-1。此外还初步进行了司帕沙星在小鼠组织中的分布情况的研究。2采用混合酸酐法将ENR分别与载体蛋白(BSA和OVA)偶联,制备免疫抗原ENR-BSA(?)口包被抗原ENR-OVA。分别经紫外光谱、红外光谱和荧光光谱证明偶联的四种人工抗原偶联成功,并通过紫外光谱法计算出ENR在各个蛋白质上的偶联数。通过相同的免疫剂量和免疫方法,制备抗血清。ELISA方法检测得到的抗血清,效价达到1：102400,理想包被抗原的浓度为500 ng/mL,抗血.清的工作浓度为1：25600。优化条件后,得回归曲线y=-0.2288x+1.0147(R2=0.9852),检测范围为5 ng/m1-2μg/mL。抗血清与其他选择的同类喹诺酮类药物和非同类药物基本无交叉反应,说明本实验所制备的抗血清特异性强。在牛奶、猪肉、小鼠血.浆和小鼠尿液中的加样回收率分别为98.4%-105.8%、94.2%-102.4%、91.7%-101.2%和97.0%-110.3%。相对应的相对标准偏差为5.6%-10.6%、5.7%-17.9%、4.8%-7.2%和4.5%-9.6%。选择九个不同的浓度,进行ELISA方法和HPLC方法相关性的比较,得到回归方程为：y=0.9866x+0.5906(R2=0.9892),司时用两种方法检测恩诺沙星注射液中恩诺沙星的含量,结果相似。说明两种检测方法具有较好的相关性。为了进一步扩大ELISA方法的使用范围,以大鼠为实验模型,探讨了恩诺沙星的体内药代动力学过程,测得了恩诺沙星药代动力学参数：Tmax为0.75 h,Cmax为3.011 mg L-1,AUC(0-∞)为33.533 mghL-1。此外还初步进行了恩诺沙星在小鼠组织中的分布情况的初步研究。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
第一章绪论  11-17
  1.1 引言  11-12
  1.2 喹诺酮类药物残留的检测方法  12-15
  1.3 ELISA方法原理  15
  1.4 课题研究的目的和意义  15-16
  1.5 课题研究的主要过程  16-17
第二章司帕沙星的ELISA检测方法的建立和应用  17-42
  1 实验部分  17-26
    1.1 实验试剂、仪器和动物  17-19
    1.2 SPFX-BSA和SPFX-OVA的合成和鉴定  19-21
    1.3 抗血清的制备  21-22
    1.4 ELISA检测方法条件的建立  22-23
    1.5 ELISA方法标准曲线的绘制  23
    1.6 ELISA和HPLC检测方法的相关性  23-24
    1.7 生物样品中ELISA的加样回收率的测定  24-25
    1.8 司帕沙星片剂和胶囊中司帕沙星含量测定  25
    1.9 司帕沙星在生物体内分析  25-26
  2 结果和分析  26-41
    2.1 SPFX-BSA和SPFX-OVA抗原的鉴定  26-29
    2.2 抗血清的制备及鉴定  29-31
    2.3 ELISA检测方法条件的建立  31-32
    2.4 ELISA标准曲线的绘制  32-33
    2.5 ELISA和HPLC检测方法的相关性  33-35
    2.6 生物样品中SPFX的加样回收率的测定  35-36
    2.7 司帕沙星片剂和胶囊的含量测定  36-37
    2.8 司帕沙星在动物体内的研究  37-41
  3 本章小结  41-42
第三章恩诺沙星的ELISA检测方法的建立及应用  42-67
  1 实验部分  43-50
    1.1 实验试剂、仪器和动物  43-44
    1.2 ENR-BSA和ENR-OVA的合成和鉴定  44-45
    1.3 抗血清的制备  45-47
    1.4 ELISA检测方法条件的建立  47-48
    1.5 ELISA方法标准曲线的绘制  48
    1.6 ELISA和HPLC检测方法的相关性  48-49
    1.7 食品中ENR的加样回收率的测定  49
    1.8 注射剂中恩诺沙星的含量测定  49
    1.9 恩诺沙星体内研究分析  49-50
  2 结果与分析  50-65
    2.1 ENR-BSA和ENR-OVA抗原的鉴定  50-54
    2.2 抗血清的制备及鉴定  54-56
    2.3 ELISA检测方法条件的建立  56-58
    2.4 ELISA标准曲线的绘制  58-59
    2.5 ELISA和HPLC检测方法的相关性  59-60
    2.6 生物样品中ENR的ELISA的加样回收率的测定  60-61
    2.7 注射剂中恩诺沙星的含量测定  61-62
    2.8 恩诺沙星在动物体体内的研究  62-65
  3 本章小结  65-67
第四章论文结论  67-69
参考文献  69-74
个人简历  74-75
硕士期间论文发表情况  75-76
致谢  76

司帕沙星和恩诺沙星抗血清制备及其ELIAS分析应用

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