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基于APRIL突变体的新型抗肿瘤分子的筛选与初步鉴定

作　者: 高全胜
导　师: 黄复生
学　校: 第三军医大学
专　业: 病原生物学
关键词: 增殖诱导配体 肿瘤 融合蛋白 HEL T辅助细胞表位 抗体 免疫治疗 白血病
分类号: R73-3
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


恶性肿瘤严重威胁着人类健康,探寻抗恶性肿瘤的新策略一直是基础与临床研究的热点和难点。APRIL亦TALL-2(TNF and apoptosis ligand-related leukocyte-expressedligand 2),于1998年被发现和克隆,属TNF超家族新成员,细胞表面的APRIL经furin转换酶裂解,其部分胞外区从膜上脱落,成为天然sAPRIL(可溶型,即105-250氨基酸区域),其生物学活性与全长(即膜结合型)APRIL基本一致,研究表明105-250氨基酸为人APRIL发挥功能的主要区域。近年研究表明,在多种恶性肿瘤细胞增殖、存活以及促肿瘤形成过程中,APRIL过表达均发挥独特作用,故有效抑制该分子表达或功能活性,可望为抗肿瘤治疗提供新策略。Dalum等人提出,经异源T辅助细胞(T helper cell,Th)表位修饰的自身突变细胞因子,可作为具有交叉反应性的新抗原,诱生内源性抗天然细胞因子抗体。该理论在抗TNF-α的实验研究中得到证实。基于此,本研究开展如下工作:①克隆编码人天然sAPRIL的cDNA,以此为模板,经PCR分别克隆缺失不同区域的sAPRIL cDNA突变体(msAPRIL cDNA);②将HEL Th表位的DNA序列重组于各msAPRIL cDNA的5′端或3′端,然后将重组DNA分别克隆于原核表达载体(本项目选用pQE-80L),制备由msAPRIL和HEL Th表位组成的融合蛋白;③将融合蛋白纯化,并证实相应融合蛋白已丧失正常sAPRIL的功能活性;④用各融合蛋白分别免疫正常小鼠,使融合蛋白交叉诱生抗人sAPRIL抗体,并观察其对人sAPRIL促肿瘤细胞增殖的抑制作用;⑤以人外周血单个核细胞重建裸鼠免疫功能,用能诱导出较高滴度抗人sAPRIL抗体的融合蛋白免疫该裸鼠,观察相应融合蛋白交叉诱生抗人sAPRIL抗体的作用,以及相应抗体对人sAPRIL促肿瘤细胞增殖的抑制作用,并初步探索该策略对白血病小鼠的治疗作用。本课题获得如下结果:1.构建了编码人sAPRIL的cDNA(aa105-aa250)借助RT-PCR,从人外周血单个核细胞中将其克隆,将其构建于pQE-80L,序列分析表明与GenBank所报道编码sAPRIL的cDNA序列完全一致。2.构建了经HEL Th表位修饰、缺失不同区域的sAPRIL cDNA突变体(msAPRILcDNA)借助PCR,以pQE-80L/sAPRIL为模板,分别克隆缺失不同区域的sAPRIL cDNA突变体,通过核酸连接技术在相应缺失端加入HEL Th表位。3.构建了突变体原核表达载体将经HEL Th表位修饰、缺失不同区域的sAPRIL cDNA突变体分别克隆于原核表达载体pQE-80L,测序证实序列正确。4.制备了融合蛋白在大肠杆菌中诱导sAPRIL及各融合蛋白表达,并借助Western blot鉴定表达产物。5.纯化了蛋白产物表达产物经SDS-PAGE检测,主要以包涵体形式存在。用Ni-NTA柱纯化包涵体溶解物,目的蛋白洗脱液经多步透析法复性后冷冻抽干,获得一定量各种纯化蛋白。6.筛选出不具有sAPRIL生物活性的突变体蛋白借助MTT法证实:N、C端均连接HEL Th表位的重组sAPRIL突变融合蛋白,其在体外能刺激Raji细胞增殖;经HEL Th表位修饰、N/C端缺失45bp(简称C、D)或90bp(简称E、F)的sAPRIL突变融合蛋白,其在体外不能刺激Raji细胞增殖。由此表明,已成功制备不具活性的sAPRIL突变体C、D、E和F,且HEL Th表位加入并不影响sAPRIL活性。7.探讨了不具生物活性的突变融合蛋白诱导小鼠产生多克隆抗体的作用将C、D、E和F纯化蛋白加佐剂后免疫小鼠,经ELISA和Western blot鉴定,融合蛋白能刺激小鼠产生多克隆抗体,同时获得抗C、D、E和F的抗血清。8.探讨了抗sAPRIL突变体多抗对sAPRIL生物活性的影响采用MTT检测发现:抗C、D、E和F抗血清可分别抑制sAPRIL促Raji和Jurkat细胞增殖作用(但抗F抗血清对sAPRIL促Raji细胞增殖作用无影响),其中以抗D抗血清抑制效果最强。9.探讨了突变体D及其抗血清的生物学作用用突变体D免疫无渗漏的SCID小鼠,采用ELISA和Western blot鉴定抗体产生,MTT检测该多克隆抗体对sAPRIL促Raji和Jurkat细胞增殖的影响。结果发现:成功获得抗人sAPRIL的多克隆交叉抗体;该多克隆抗体能抑制sAPRIL促Raji和Jurkat细胞增殖作用。初步表明:已筛选出基于增殖诱导配体的新型抗瘤效应分子。10.验证了突变体D纯化蛋白对白血病动物的疗效体外试验证实:sAPRIL呈剂量依赖性促进P388白血病细胞增殖;突变体D丧失刺激P388白血病细胞增殖的活性;用突变体D纯化蛋白干预P388诱导的白血病小鼠,能延长其生存期,但参照T/C值(评价药物抗瘤作用的常用指标)该治疗无效。

全文目录


英文缩写一览表  6-9
英文摘要  9-12
中文摘要  12-15
论文正文 基于APRIL突变体的新型抗肿瘤分子的筛选与初步鉴定  15-85
  前言  15-17
  第一部分 sAPRIL突变体的设计、构建  17-34
    材料  17-19
    方法  19-28
    结果  28-31
    讨论  31-34
  第二部分 sAPRIL突变体的表达、纯化及活性鉴定  34-55
    材料  34-35
    方法  35-40
    结果  40-51
    讨论  51-55
  第三部分 抗sAPRIL突变体多克隆抗体制备及活性鉴定  55-69
    材料  55-56
    方法  56-58
    结果  58-66
    讨论  66-69
  第四部分 基于sAPRIL突变体的干预策略——sAPRIL突变体抗白血病的体内实验——  69-76
    材料  69-70
    方法  70-72
    结果  72-74
    讨论  74-76
  全文总结及结论  76-78
  致谢  78-79
  参考文献  79-82
  附录 常用试剂的配制  82-85
文献综述一  85-96
  参考文献  93-96
文献综述二  96-129
  参考文献  117-129
附1: 博士研究生期间发表的文章  129-130
附2: 基金资助情况  130

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 肿瘤学实验研究
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