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残粒脂蛋白对循环内皮祖细胞血管新生的影响

作　者: 刘哲亮
导　师: 胡建国
学　校: 中南大学
专　业: 外科学
关键词: 残粒脂蛋白内皮祖细胞血管新生血管内皮功能损害后肢缺血微小RNA
分类号: R329
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

背景与目的：内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells, EPCs)的数量和功能与血管内皮功能明确相关。细胞复制性衰老是指细胞失去分化能力,同时发生相应形态学改变和其它功能障碍。危险因素通过氧化机制加速EPCs的衰老进程。残粒脂蛋白(Remnant lipoproteins, RLPs)可通过氧化机制直接导致血管内皮舒张功能损害和成熟内皮细胞分泌功能的异常,但是还不清楚RLPs是否还影响EPCs衰老及其功能。本研究拟观察RLPs对EPCs衰老、增殖、迁移、粘附和体外血管新生能力的影响。方法：采用已建立的高脂餐方案：总热量为800千卡(脂肪50克、蛋白质28克、碳水化合物60克),采集高甘油三酯血症患者脂餐后4小时EDTA抗凝静脉血标本。应用免疫亲和层析法和密度梯度超速离心技术分离人血浆RLPs, BCA法测定RLPs的蛋白含量。密度梯度离心法分离人外周血的单个核细胞,利用添加生长因子的M 199条件培养基诱导单个核细胞贴壁向EPCs分化。流式细胞仪、双荧光染色、直接免疫荧光染色和普通免疫细胞化学染色鉴定EPCs。1)将不同浓度(0-200μg/mL)的RLPs加入第10天的EPCs,分别培养6、12、24及48小时。采用衰老相关的p-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase, SA-β-Gal)染色技术,在PH6的条件下,计数强SA-β-gal活性的EPCs,获取RLPs影响EPCs衰老进程的最大效应浓度(CR)和最佳干预时间(TR)。2)将培养第10天EPCs以添加CR浓度RLPs的M199条件培养液培养TR时间,再加入不同浓度(0.01-10μmol/L)的阿托伐他汀(Atorvastatin,ATR),分别培养6、12、24及48小时。采用SA-β-gal染色技术,在PH6的条件下,计数强SA-β-gal活性的EPCs,获取ATR影响EPCs衰老进程的最大效应浓度(CA)和最佳干预时间(TA)。3)分为空白对照组、RLPs刺激组、ATR干预组和RLPs刺激+ATR干预组。将浓度为CR的RLPs、浓度为CA的ATR和对照物于细胞培养第10天加入EPCs,分别作用相应时间。采用SA-β-gal染色技术,在PH6的条件下,计数强SA-β-gal活性的EPCs,检测各干预措施对EPCs衰老的影响。4)观察RLPs对EPCs功能的影响分为空白对照组、RLPs刺激组、ATR干预组和RLPs刺激+ATR干预组。将浓度为CR的RLPs、浓度为CA的ATR和对照物于细胞培养第10天加入EPCs,分别作用相应时间。①改良的Boyden小室评价细胞迁移能力。②粘附能力测定实验评价细胞粘附能力。③MTT比色法评价细胞增殖能力。④Matrigel成血管网实验评价EPCs在体外的血管新生能力。结果：(1)外周血单个核细胞用添加生长因子的M199条件培养基培养可诱导分化成EPCs,具备典型的形态学和表型特征；(2)从高甘油三酯血症患者静脉血中制得RLPs,经BCA法测定的RLPs蛋白浓度值为4.28±0.36mg/mL;(3) RLPs的最大效应浓度为100μg/mL,最佳干预时间为24小时；ATR的最大效应浓度为1.0μmol/L,最佳干预时间为24小时；(4) RLPs刺激能使EPCs的SA-β-Gal活性增加,EPCs衰老细胞数增加,其迁移、粘附、增殖和形成微血管网的能力显著降低；(5)ATR治疗可以降低EPCs的SA-β-Gal活性,显著减少EPCs衰老细胞数,增强其迁移、粘附、增殖和形成微血管网的能力。结论：RLPs可以导致EPCs衰老并抑制其血管新生的相关功能,ATR治疗可以改善RLPs对EPCs的上述负面影响。背景与目的：裸鼠后肢缺血模型是目前国际上最常采用的用于评价EPCs移植治疗效果的实验动物模型。采用裸鼠后肢缺血模型,通过移植DAPI标记的EPCs,并运用免疫组化技术、细胞衰老生物标记染色技术和激光多普勒血流成像技术,观察RLPs对EPCs移植后裸鼠缺血后肢血运重建的影响。方法：参照Heeschen等的方法(Circulation,2004;109:1615-22),应用8-10周龄BALB/c雄性裸鼠建立后肢缺血裸鼠模型,缺血手术24小时后,以PBS液作对照,由尾静脉注入体外扩增培养10天且经DAPI荧光标记的EPCs至裸鼠体内。于EPCs移植第1天开始,每间隔48小时经由尾静脉注入RLPs或对照物；同时根据ATR应用情况,将裸鼠分为：对照组、RLPs刺激组、ATR干预组、RLPs刺激+ATR干预组。激光多普勒血流扫描仪监测后肢的血液灌流情况。21天后,处死裸鼠,取缺血后肢与正常后肢腓肠肌做病理切片。免疫组化法检测缺血组织的新生微血管密度和EPCs的组织分布情况。采用SA-β-gal染色技术,在PH6的条件下,计数强SA-β-gal活性的血管数目。结果：(1)成功建立裸鼠后肢缺血模型,缺血后肢末梢循环、运动功能、血流灌注情况随时间发生规律改变,组织病理学改变符合缺血特征；(2) EPCs移植可以显著降低缺血后肢的伤残率；(3) RLPs刺激组的EPCs组织分布数、新生毛细血管密度和缺血后肢血流灌注要显著低于其他各组,可以观察到新生血管的衰老现象；(4)ATR治疗组的EPCs组织分布数、新生毛细血管密度和缺血后肢血流灌注要显著高于其他各组。结论：RLPs通过刺激EPCs衰老而抑制其在体内的血管新生能力,ATR治疗可以改善EPCs受损的血管新生能力。背景与目的：微小RNA(microRNA, miRNA)是新近证明的一类高度保守的、内源性非蛋白编码的长度约为20-24个核苷酸的小分子RNA,参与调节血管内皮细胞或胚胎干细胞的血管新生,参与调控细胞衰老。通过对RLPs干预体外培养EPCs的研究,利用miRNA芯片技术检测相关miRNA的改变情况,以初步了解miRNA是否参与调控RLPs对EPCs血管新生的影响。方法：取培养第10天EPCs,分为RLPs干预组和对照组,采用Agilent的人microRNA寡核苷酸基因芯片寻找显著差异表达的miRNA,构建RLPs干预组和对照组的miRNA表达谱：用mirVana RNA Isolation Kit提取两组EPCs的总RNA并进行纯化；使用Nanodrop分光光度计(NP-1000)测定RNA在260nm和280nm波长的吸收值,计算样本总RNA浓度并评估纯度；采用Agilent RNA 6000 Nano Assay检测RNA纯度及完整性；采用Agilent’s miRNA Complete Labeling and Hyb Kit进行：miRNA荧光标记和芯片杂交；采用Agilent’s Gene Expression Wash Buffer Kit进行杂交芯片的洗脱；使用Agilent Microarray Scanner扫描芯片的荧光强度并借助Agilent Feature Extraction Software提取原始数据进行分析运算,筛选两组间差异表达显著的miRNA。结果：与对照组相比,EPCs经RLPs干预后显著异常表达的miRNA共有4个,显著上调表达miRNA有3个,分别为：hsa-miR-148b*、hsa-miR-155*和hsa-miR-513c;一个显著下调的miRNA,即hsa-miR-574-3p。结论：miRNA可能参与调控RLPs对EPCs血管新生的影响。

全文目录

中文摘要  3-10
英文摘要  10-18
缩略词表  18-19
第一章残粒脂蛋白对循环内皮祖细胞体外血管新生的影响  19-58
  前言  19-21
  第一节人外周血EPCs的分离、培养、鉴定和RLPs的制备  21-39
  第二节残粒脂蛋白对循环EPCs体外血管新生功能的影响  39-54
  讨论  54-57
  结论  57-58
第二章残粒脂蛋白对EPCs移植后裸鼠缺血后肢血运重建的影响  58-87
  前言  58-60
  第一节裸鼠后肢缺血动物模型的建立  60-70
  第二节残粒脂蛋白对EPCs移植后裸鼠缺血后肢血管新生的影响  70-83
  讨论  83-86
  结论  86-87
第三章残粒脂蛋白影响循环EPCs血管新生的可能机制探讨  87-105
  前言  87-88
  材料与方法  88-93
  结果  93-95
  附图  95-99
  讨论  99-104
  结论  104-105
参考文献  105-115
综述  115-134
致谢  134-135
攻读学位期间发表论文及参与科研情况  135

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