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抗HBV药物的分子药效学评价模型以及减少HBV耐药的策略研究

作　者: 刘飞
导　师: 蒋建东；彭宗根；李玉环
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 乙肝病毒 cccDNA 负链正链抗HBV药物的分子药效学评价模型拉米夫定阿德福韦酯恩替卡韦氧化苦参碱膦甲酸钠联合治疗
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

CccDNA (covalently closed circular DNA)是乙肝病毒(hepatitis B virus)建立以及维持感染的分子基础,并在停药反弹和核苷类药物(nucleotide or nucleoside anologues, NAs)耐药产生方面扮演着关键角色。针对cccDNA增殖机制开发新型抗病毒药物,或者在现有条件下开发新的治疗策略来阻止肝脏细胞内cccDNA分子的形成以及降低cccDNA库是乙肝防治的核心课题之一CccDNA增殖过程几乎涉及到整个HBV DNA复制环节,那么临床常用药物在哪个环节抑制cccDNA增殖,有没有主要的作用环节?对于临床耐药率低的NAs有没有特征性的抑制cccDNA增殖的药效规律?深入研究这些问题不仅有助于解释临床耐药现象,更有助于发现强效抑制cccDNA增殖的药物,甚至为联合治疗提供新的研究和评价方法。针对上述问题,本课题采用了临床抗HBV药物作为“小分子药物探针”的研究策略。氧化苦参碱(OMTR)、膦甲酸钠(PFA)、拉米夫定(3TC)、阿德福韦酯(ADV)和恩替卡韦(ETV)是5种分子结构不同的小分子化合物,在临床上均有明确的抗HBV作用。它们分别属于不同靶点、不同靶位或者同靶位但不同结合方式的药物。OMTR通过降低宿主蛋白HSC70 mRNA的稳定性来抑制HBV复制,PFA作用于HBV复制酶焦磷酸结合的位点；3TC、ADV和ETV三种药物都以病毒复制酶为靶点但结合模式不同。基于这些化合物对HBV复制过程不同机制的干预,有可能通过针对性的研究揭示出它们各自抑制cccDNA增殖的药效规律。因此本课题主要的研究目的是通过对药物抑制cccDNA增殖机制的研究,寻求增强抗HBV药效以及克服乙肝临床耐药的策略。本课题建立了一系列qPCR(real-time quantitative PCR, qPCR),用于检测HBV不对称复制过程中主要的复制步骤,即负链、正链复制和cccDNA的合成。在传代HepG2.2.15细胞(整合有HBV全基因组的稳定转染细胞系)内,cccDNA增殖是HBV复制周期中主要的分子事件,HBV包膜蛋白的负反馈调节机制对cccDNA增殖过程影响有限,在此时段内cccDNA自然增殖途径相对“简化”,便于研究药物作用机制。基于上述条件,本课题提出“抗HBV药物的分子药效学评价模型”。该模型基于对HBV主要复制步骤定量地检测,在cccDNA增殖期研究药物作用机制,结合药效动力学和偏相关性分析可以综合地评价药物作用后负链、正链等复制步骤在cccDNA增殖过程中的主次作用,从而判断药物抑制cccDNA增殖的分子药理学机制。因此本模型是一个多层次的研究体系,将特异性HBV不对称复制机制融入到HBV药效学研究中,用于研究药物在HBV整个复制周期中主要的分子药效学机制。3TC、ADV和ETV三种NAs作用于HepG2.2.15细胞后,可以有效地抑制cccDNA的增殖。因为HBsAg生物学意义和cccDNA相近,本课题对HBsAg胞外分泌水平进行了测量。结果显示HBsAg可以定量、定性地反映NAs作用后cccDNA降低的趋势。通过对HBV正、负链复制以及cccDNA增殖抑制的剂量-药效曲线整体性地分析,以及结合药效动力学和统计学偏相关分析等方法的数据,结果表明NAs通过不同的分子药效学机制来抑制cccDNA的增殖。3TC、ETV和ADV三种药物可能分别主要在负链复制、正链复制和正链补全阶段发挥抑制cccDNA增殖的药效。其中ETV和ADV的药效学机制进一步得到其它数据的证实。本室前期工作通过系列实验证实OMTR可降低HSC70 mRNA的稳定性,而HSC70在HBV逆转录过程发挥辅助复制的作用,因此OMTR通过降低HSC70的丰度来抑制HBV复制。本课题进一步发现HSC70蛋白CC区(与底物蛋白结合的功能域)与辅助HBV复制功能密切相关。通过qPCR体系检测OMTR对HBV正、负链以及cccDNA的影响,发现OMTR同等水平地抑制HBV正、负链复制以及cccDNA的增殖,与NAs抑制模式有很大的不同。结合以往研究的结果,OMTR可能主要通过下调负链复制水平来抑制cccDNA的增殖。PFA抗病毒的药效较弱,在1667μM的剂量时才出现对HBV复制比较明显的抑制作用。PFA抑制HBV正、负链复制以及cccDNA增殖药效大小的顺序为负链<正链<cccDNA。表明PFA在正链补全阶段具有较强的抑制活性,并最终抑制cccDNA增殖。本课题进一步评价了3TC、ADV和ETV三种NAs联合治疗的药效。数据表明,所有六种NAs联合方案在降低细胞内HBV负链复制上表现为协同或叠加作用。在六种联合方案中,仅3TC和ADV相互联合的两种方案在HBV正、负链复制,以及cccDNA增殖多个层次上表现为协同抑制作用,与临床结果相吻合。以细胞外HBV DNA作为评价指标,结果显示六种NAs联合方案对细胞外HBV DNA水平没有影响。总之,“抗HBV药物的分子药效学评价模型”具有潜在的理论价值,适用于研究药物抑制HBV cccDNA增殖的分子药效学机制,发现和评价有效的NAs联合治疗方案。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
缩略语表  11-14
前言  14-20
1 材料与方法  20-37
  1.1 实验材料  20-24
    1.1.1 细胞系  20-21
    1.1.2 药物  21
    1.1.3 主要生化试剂  21-22
    1.1.4 质粒和细菌菌株  22
    1.1.5 分子生物学试剂盒  22
    1.1.6 主要仪器  22-24
  1.2 实验方法  24-37
    1.2.1 细胞总mRNA提取和cDNA的合成  24
    1.2.2 细胞DNA提取  24-26
    1.2.3 基本分子生物学实验方法  26-29
    1.2.4 构建HBV重组质粒  29-30
    1.2.5 构建多种HSC70蛋白功能区缺失型的真核表达质粒  30-31
    1.2.6 HBV DNAqPCR检测体系  31-32
    1.2.7 HepG2.2.15细胞培养以及药物处理  32
    1.2.8 HBV cccDNA、细胞内病毒DNA提取以及处理  32-33
    1.2.9 数据处理及数据分析  33
    1.2.10 Southern blot  33-35
    1.2.11 HBsAg和HBeAg定量检测  35
    1.2.12 NAs抑制HBV DNA复制的药效动力学及米氏方程  35-37
2 实验结果  37-88
  2.1 第一部分不同作用机制的药物抑制cccDNA增殖的策略  37-79
    2.1.1 乙肝病毒DNA qPCR检测技术的建立  37-42
    2.1.2 HBV qPCR检测体系的生物学意义  42-44
    2.1.3 HepG2.2.15适用于研究药物抑制cccDNA增殖的机制  44-46
    2.1.4 NAs抑制cccDNA增殖的特征和机制  46-48
    2.1.5 HBsAg定性、定量地反映NAs作用后cccDNA载量的变化  48-52
    2.1.6 3TC主要通过抑制HBV负链的合成来阻止cccDNA的增殖  52-56
    2.1.7 ETV通过阻断HBV正链的复制来抑制cccDNA的增殖  56-62
    2.1.8 ADV在正链补全阶段抑制cccDNA的增殖  62-67
    2.1.9 氧化苦参碱在负链复制水平抑制cccDNA的增殖  67-71
    2.1.10 大剂量PFA对cccDNA的增殖具有较强的抑制活性  71-72
    2.1.11 讨论  72-79
  2.2 第二部分NAs联合抑制HBV DNA复制的相关机理  79-88
    2.2.1 联合治疗在抑制细胞内HBV负链上表现为协同或叠加作用  80-81
    2.2.2 3TC联合ADV可协同抑制细胞内HBV正链的复制  81-82
    2.2.3 3TC、ADV相互联合可协同抑制cccDNA的增殖  82-83
    2.2.4 联合治疗没有促进对分泌型HBV DNA复制的抑制作用  83-87
    2.2.5 讨论  87-88
3 结论  88-90
参考文献  90-99
论文综述  99-109
论文发表以及学术会议  109-110
发表论文  110-114
致谢  114

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