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转基因毛白杨生理生化特性及多基因表达载体构建

作　者: 贾香楠
导　师: 陈晓阳
学　校: 北京林业大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: rolB-pttGA20ox双价基因毛白杨 Bt基因 BADH基因 Cre/loxP重组系统多基因组装
分类号: S792.11
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本文以4个转rolB-pttGA20ox双价基因毛白杨株系和1个对照株系PT-16为材料,探讨了rolB-pttGA20ox双价基因对毛白杨生根生理、光合特性、抗逆性以及生长的影响。为进一步提高毛白杨的抗虫性和耐盐碱能力,采用一套基于Cre/loxP重组系统的植物多基因表达载体系统将苏云杆菌毒蛋白基因(BtCrylAc)、甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)、GA20氧化酶基因(pttGA20ox)和rolB基因构建于同一植物表达载体pYL1305上,转化烟草,验证了多基因的表达和功能。主要研究结果如下：1、转rolB-pttGA20ox双价基因毛白杨试管苗生根过程中内源IAA、GA3、ZR和ABA含量变化与对照差异明显,各项生根指标均高于对照。转基因株系不同程度地增大了对光的生态适应范围,其净光合速率与地径显著相关,与苗高相关不显著。盆栽期,各株系间苗高存在极显著差异,RG-1、RG-2和RG-3显著的高于RG-4和对照PT-16,地径差异不显著；移入大田后,各株系间苗高差异不显著,而地径出现显著差异,RG-4的平均苗高最高,达到了231.25cm,转基因株系中RG-4的平均地径最大,为13.91mm。对各株系的SOD活性和MDA含量测定表明,转基因株系RG-4对逆境的抵抗力最强,但与对照PT-16差异不显著。rolB-pttGA20ox双价基因的表达可能改变了毛白杨相关的生理代谢途径,同时,转基因株系在光合特性、生长、抗逆性等方面的差异明显,这也为选择优良的转基因株系提供了材料。2、采用PCR方法,扩增Bt基因,替换植物表达载体pYL1305中的gus基因,得到pYL1305-Bt。扩增CaMV35S-BADH-nos表达盒,并插入到pYL1305-Bt的多克隆位点,得到载体pYL 1305-Bt-BADH。将CaMV35S-GA20ox-nos表达盒、GH3-rolB-nos表达盒分别克隆到供给载体pYL-d1、pYL-d2上,经两轮重组得到多基因单载体pYL1305-Bt-BADH-GA20ox-rolB,并将其转化根癌农杆菌菌株EHA105。3、采用农杆菌介导的叶盘法将多基因转化烟草,对获得的抗性芽在含25mg／LHyg的培养基中进一步选择后进行分子检测,PCR检测和Southern杂交检测证明多基因已插入到烟草基因组中。进一步的RT-PCR检测证明,外源基因均得到表达,多基因表现为串联在一起插入到同一位点,其中转基因株系T2中各基因的表达量最高。4、转多基因烟草植株根部、茎部和叶片中IAA的含量均高于对照,分别是是对照的1.90倍、1.92倍和1.17倍；转化植株各部位的GA3含量均高于对照,转化植株中茎部GA3含量最高,叶片最低；转化植株的根、茎部ABA含量略低于对照,叶片中ABA含量高于对照；转化植株各部位的IAA/ABA比值均高于对照,其中根部的IAA/ABA值最高,是对照的1.82倍。5、转多基因烟草耐盐性试验表明,当NaCl为300mM时,对照生长受到抑制,叶片膨大黄化,不能生根,转基因植株生长正常,叶片保持绿色,并能正常生根。转基因烟草经不同浓度的NaCl长时间胁迫,其SOD活性高于对照,MDA含量变化幅度较小,而对照MDA含量随盐浓度升高而大幅降低。6、转基因烟草植株的茎、叶中均检测到了Bt毒蛋白,T2株系Bt毒蛋白含量最高,叶片中达到了585.53 ng/g.FW,茎中为573.66 ng/g.FW,而对照中没有检测到Bt毒蛋白。抗虫试验结果表明,饲喂一周后,转基因烟草对2龄舞毒蛾的校正死亡率为78.05%,对3龄斜纹夜蛾的死亡率为30.00%,并明显抑制了存活幼虫的生长发育。7、移栽后的转基因烟草植株高生长更加明显,节间伸长,表现出了pttGA20ox基因表达的性状特征,转基因植株地径也显著增大、叶片大而深绿、植株健壮,移栽4 W后转化植株平均苗高为19.28cm,地径为5.34mm,分别是对照的1.61倍和1.37倍。多基因在烟草中均能正常表达,没有出现基因沉默等现象,说明在构建多基因表达载体时,使用一定数目的同源序列的启动子和终止子是可行的,但随着基因的增多应该考虑更换不同启动子或在基因两端添加核基质结合区(MAR)序列以避免转基因沉默。多基因单载体的构建和各基因的正常表达为进一步的毛白杨等林木改良奠定了重要基础。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
本文缩略词  7-12
1 引言  12-28
  1.1 研究目的与意义  12-13
  1.2 植物多基因转化研究方法  13-17
    1.2.1 基因枪共转化法  13-14
    1.2.2 重复转化法  14
    1.2.3 杂交法  14
    1.2.4 质体转化法  14-15
    1.2.5 多基因单载体转化法  15-17
  1.3 Bt基因功能及在植物基因工程中的应用  17-19
    1.3.1 Bt基因的特性和分类  17-18
    1.3.2 Bt基因在植物基因工程中的应用  18-19
  1.4 甜菜碱与植物抗逆性  19-21
    1.4.1 甜菜碱在植物中的代谢途径  19-20
    1.4.2 甜菜碱合成相关酶研究进展  20-21
  1.5 Ri质粒和rol基因群研究进展  21-23
    1.5.1 Ri质粒结构与功能  21-22
    1.5.2 rol(rooting locus)基因及其编码蛋白的功能  22-23
    1.5.3 rolB基因在植物基因工程中的应用  23
  1.6 赤霉素与GA20-氧化酶研究进展  23-25
  1.7 研究的主要内容和技术路线  25-28
2 转rolB-pttGA20ox双价基因毛白杨生理生化特性研究  28-49
  2.1 材料与方法  28-36
    2.1.1 转双价基因植株分子检测  28-32
    2.1.2 转基因植株生根过程中内源激素含量测定  32-34
    2.1.3 转基因植株光合特性分析  34
    2.1.4 转基因植株生长测定  34-35
    2.1.5 转基因植株超氧化物岐化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的测定  35-36
    2.1.6 统计方法  36
  2.2 结果与分析  36-45
    2.2.1 转rolB-pttGA20ox双价基因植株的PCR检测  36
    2.2.2 转rolB-pttGA20ox双价基因植株的PCR-Southem检测  36-37
    2.2.3 转rolB-pttGA20ox双价基因植株生根过程中内源激素的变化  37-39
    2.2.4 转rolB-pttGA20ox双价基因植株的光合特性分析  39-42
    2.2.5 转rolB-pttGA20ox双价基因植株生长测定  42-43
    2.2.6 转基因植株的SOD活性和MDA含量测定  43-45
  2.3 讨论  45-48
    2.3.1 无性繁殖阶段外源基因的遗传稳定性  45
    2.3.2 转基因毛白杨生根过程中内源激素含量变化  45-46
    2.3.3 转基因毛白杨盆栽苗光合特性的变化  46
    2.3.4 转基因植株的SOD活性和MDA含量变化  46-47
    2.3.5 转基因毛白杨盆栽期和田间生长的差异  47
    2.3.6 转基因毛白杨植株间的差异  47-48
  2.4 小结  48-49
3 基于Cre/LoxP重组系统的多基因表达载体构建  49-70
  3.1 材料与方法  49-62
    3.1.1 基因、质粒与菌株  49
    3.1.2 细菌培养基配方  49-50
    3.1.3 酶和试剂  50
    3.1.4 重要仪器  50
    3.1.5 植物表达载体pYL1305-Bt-BADH-GA20ox-rolB的构建策略  50-57
    3.1.6 质粒提取  57
    3.1.7 PCR扩增  57-59
    3.1.8 目的片段的纯化  59-60
    3.1.9 酶切反应  60
    3.1.10 连接反应  60
    3.1.11 大肠杆菌感受态细胞的制备  60-61
    3.1.12 连接产生转化大肠杆菌  61
    3.1.13 多基因组装  61
    3.1.14 植物表达载体转化农杆菌  61-62
    3.1.15 PCR鉴定目的基因及测序  62
  3.2 结果与分析  62-67
    3.2.1 植物表达载体pYL1305-Bt的构建  62-63
    3.2.2 植物表达载体pYL1305-Bt-BADH的构建  63-64
    3.2.3 植物表达载体pYL1305-Bt-BADH-GA20ox的构建  64-66
    3.2.4 植物表达载体pYL1305-Bt-BADH-GA20ox-rolB的构建  66-67
    3.2.5 植物表达载体pYL1305-Bt-BADH-GA20ox-rolB转化农杆菌  67
  3.3 讨论  67-69
  3.4 小结  69-70
4 农杆菌介导多基因表达载体转化烟草  70-78
  4.1 材料与方法  70-72
    4.1.1 植物材料  70
    4.1.2 质粒和菌株  70
    4.1.3 试剂  70
    4.1.4 烟草遗传转化培养基  70-71
    4.1.5 烟草对抗生素的敏感性试验  71
    4.1.6 农杆菌的活化及工程菌液的制备  71
    4.1.7 叶盘法遗传转化的步骤  71-72
    4.1.8 转基因植株的PCR扩增检测  72
    4.1.9 转基因植株的PCR-Southern和Southern杂交  72
  4.2 结果与分析  72-75
    4.2.1 潮霉素对烟草叶片分化不定芽的影响  72-73
    4.2.2 潮霉素对烟草生根的影响  73-74
    4.2.3 农杆菌介导转化与抗性筛选  74
    4.2.4 转多基因烟草植株的PCR检测  74
    4.2.5 转多基因烟草植株的PCR-Southern检测  74-75
    4.2.6 转多基因烟草植株的Southern检测  75
  4.3 讨论  75-77
    4.3.1 Hyg对烟草W38分化与生长的影响  75-76
    4.3.2 Hyg抗性植株的分子检测  76-77
  4.4 小结  77-78
5 转Bt-BADH-pttGA20ox-rolB多基因烟草外源基因的表达分析  78-92
  5.1 材料与方法  78-83
    5.1.1 试验材料  78
    5.1.2 半定量RT-PCR反应  78-81
    5.1.3 转多基因烟草植株内源激素含量的测定  81
    5.1.4 转多基因烟草植株的耐盐性试验  81
    5.1.5 转多基因烟草植株的Bt毒蛋白含量测定和抗虫试验  81-82
    5.1.6 转多基因烟草植株在温室中的生长测定  82-83
  5.2 结果与分析  83-88
    5.2.1 转多基因烟草中Bt-BADH-pttGA20ox-rolB基因的表达分析  83
    5.2.2 转多基因烟草植株内源激素含量分析  83-85
    5.2.3 转多基因烟草植株的耐盐性分析  85-86
    5.2.4 转多基因烟草植株的Bt毒蛋白检测和抗虫试验  86-88
    5.2.5 转多基因烟草植株的温室生长观测  88
  5.3 讨论  88-90
    5.3.1 Bt-BADH-pttGA20ox-rolB多基因在烟草中的表达  88-89
    5.3.2 BADH基因对转基因烟草耐盐能力的影响  89-90
    5.3.3 Bt基因对转基因烟草抗虫能力的影响  90
    5.3.4 Bt-BADH-pttGA20ox-rolB多基因对转基因烟草生长的影响  90
  5.4 小结  90-92
6 研究结论与展望  92-95
  6.1 研究结论  92-94
  6.2 展望  94-95
参考文献  95-105
图版Ⅰ  105-106
图版Ⅱ  106-107
图版Ⅲ  107-108
图版Ⅳ  108-109
个人简介  109-110
导师简介  110-111
致谢  111

转基因毛白杨生理生化特性及多基因表达载体构建

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