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应用腘窝淋巴结试验研究注射用双黄连的致敏性

作　者: 刘兆华
导　师: 周庚寅；刘兆平
学　校: 山东大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 中药注射剂腘窝淋巴结试验注射用双黄连速发型超敏反应类过敏反应
分类号: R392.3
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

中药注射剂(Traditional Chinese Medicine Injection, TCMI)突破了中药传统给药方式,是我国自主创新研制的独有中药剂型,具有生物利用度高、作用迅速等特点,克服了传统中医药不能用于治疗危急重症的弱点,在心脑血管疾病、呼吸系统疾病和肿瘤治疗中发挥重要、甚至是不可替代的作用,是中药现代化的发展方向之一。然而随着TCMI临床应用的日益广泛,其诱发不良反应的相关报道日益增多。速发型超敏反应(immediate hypersensitivity reaction, IHR)通常被认为是TCMI出现最多、危害较大的不良反应,严重时可引起患者发生过敏性休克而死亡。使得人们越来越质疑TCMI使用的安全性,进而诱发了对TCMI乃至整个中药产业的“信任危机”。如何全面、客观、科学评价TCMI存在的不良反应和风险,保证其临床用药的安全性,成为解决此次“信任危机”的重中之重。解决这个问题的关键则需要明确TCMI不良反应发生的原因和机制。TCMI通常含有3～7种原料药,多时甚至可达12种。由于成分复杂,引起致敏反应的原因和机制尚不清楚。尽管临床上使用的TCMI均是通过了严格的临床前药理毒理研究的产品,但由于使用的实验模型不能准确预测TCMI的致敏潜能,动物实验结果与临床不良反应之间缺乏相关性。现广泛应用的动物模型如,主动皮肤过敏试验(the active cutaneous anaphylaxis assay, ACA)、被动皮肤过敏试验(the passive cutaneous anaphylaxis assay, PCA)和主动全身过敏试验(the active systemic anaphylaxis assay, ASA),主要用于大分子蛋白质类抗原的致敏性检测。对小分子药物(low molecular weight compound, LMWC)而言,ASA、ACA和PCA反应阳性,提示LMWC具有致敏潜能；但PCA等反应阴性并不确定其没有致敏能力,因此容易出现假阴性结果。综上可知,限制TCMI机制研究的瓶颈是缺乏适合的实验模型,即应用新的模型探讨TCMI不良反应发生的原因和机制是解决TCMI安全性的首要问题。腘窝淋巴结试验(popliteal lymph node assay, PLNA)是目前唯一可靠的LMWC致敏性筛选方法。它具有简单、省时、灵敏、特异性高,实验动物用量少、样品使用量低的特点。依据动物足趾部接受处理因素的方式不同,PLNA可以分为直接法PLNA(Direct PLNA or Primary PLNA,d-PLNA),间接法PLNA (Secondary PLNA,s-PLNA)、过继法PLNA (Adoptive PLNA)、报告抗原PLNA (Modified PLNA or Reporter Antigen PLNA, RA-PLNA)和佐剂PLNA (Adjuvant PLNA)。其中d-PLNA和RA-PLNA最常用于药物的致敏性研究。迄今为止,不同实验室已经应用PLNA检测了130余个LMWC,研究结果获得了很好的一致性和可重复性。但已有PLNA研究的样品均是成分单一的LMWC,PLNA可否用于成分复杂的TCMI的致敏性研究尚未见报道。此外,国内目前尚未建立起PLNA方法的标准体系,亦未见PLNA方法检测化学药物或中药致敏性研究的报道。而国外文献报道所用的实验动物种属如CBA小鼠、C57BL小鼠、F344大鼠、BN大鼠等,在国内价格昂贵且不容易获得,缺乏这些动物的饲养经验和实验背景资料。鉴于此,本研究拟结合我国实际情况,首先建立d-PLNA和RA-PLNA实验模型；在国内常用的实验动物种属中选择确定敏感动物,建立一套规范、简便、可行的PLNA实验操作程序；并利用建立的d-PLNA和RA-PLNA模型研究TCMI的潜在致敏性；建立一个适于TCMI致敏性试验研究的特异、灵敏的新方法,以期明确其不良反应的发生机制,确定引起过敏反应的物质(致敏原)；这将为TCMI的安全性评价提供新的思路和实验依据,促进我国药物致敏性实验研究与国际接轨,对于我国新药的研发有重大的经济和实用价值。双黄连注射剂是最具代表性的清热解毒类TCMI之一,临床应用广泛,疗效肯定。2009年7月注射用双黄连(冻干)针剂被列入到2005年中华人民共和国药典增补本,这不仅是我国惟一进入药典的一种TCMI,也是首个采用指纹图谱控制产品质量的TCMI。但是和其他类型的TCMI一样,双黄连注射剂引起的临床不良反应病例日趋增多。根据文献报道,双黄连注射剂与鱼腥草注射液是不良反应报道最多的TCMI。双黄连注射剂引起的不良反应以Ⅰ型超敏反应为主,绝大多数表现为轻度的皮肤红斑、皮疹等；严重不良反应以全身性损害、呼吸系统损害为主,致死原因为过敏性休克或过敏样反应。国家药品不良反应监测中心已在2001年和2009年2次通报了双黄连注射剂的超敏反应,说明双黄连注射剂也同样面临被市场淘汰的危险。双黄连注射剂包括注射用双黄连灭菌粉末及双黄连注射液。双黄连注射液是最早开发成功的TCMI品种。注射用双黄连(Shuanghuanglian Injection, SHLI)是在双黄连注射液基础上发展起来的新剂型。SHLI由黄芩、金银花和连翘三种中药材精制而成,绿原酸含量较为丰富,而绿原酸被高度怀疑是一种半抗原。此外,SHLI不含任何辅料,所含的主要成分均为分子量小于1000u的小分子化合物(low molecular weight compound, LMWC)。故以SHLI为代表,通过d-PLNA和RA-PLNA研究其诱导超反应的发生机制,确定致敏原,对于保证SHLI乃至所有TCMI的临床用药安全具有重要的意义。1胭窝淋巴结试验的模型构建雌性成年SPF级雌性昆明小鼠、BALB/c小鼠、C57BL/6J小鼠、Wistar大鼠、BN大鼠随机分为空白对照组、阴性对照组和模型组。模型组右侧后肢足趾部皮下分别注射已知致敏物氯化汞(Mercury chloride, HgCl2)、双氯芬酸(Diclofenac sodium salt, DF)、D-盐酸青霉胺(D-Penicillamine, D-pen)、苯妥英钠(Diphenylhydantoin, DP)、链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ),小鼠给药体积25μl或50μl；大鼠为50μl或100μl;苯巴比妥(Phenobarbital, PB)或溶媒为阴性对照,左侧不做处理。给药7 d,吸入CO2处死动物,迅速取出左、右侧胭窝淋巴结,放入置于冰上盛有PBS (含1%BSA)的培养皿中,去除脂肪组织,吸干水分后称重,制备单细胞悬液,计算淋巴结重量指数(weight index,WI)和细胞指数(cellullarity index, CI),比较胭窝淋巴结(popliteal lymph node,PLN)反应,WI>2或CI>5为阳性反应。报告抗原胭窝淋巴结试验时则将受试物分别与TNP-OVA或TNP-Ficoll一起注入右侧后肢足趾部皮下,给药7 d,处死动物,迅速取出PLN,制备单细胞悬液,Elispot检测AFCs数量,TNP特异性AFCs增多为阳性反应。结果表明：C57BL/6J小鼠、BALB/c小鼠和BN大鼠均对阳性化合物反应敏感,提示成功构建了d-PLNA动物模型。小鼠后肢每侧均只有一个胭窝淋巴结,位置固定,容易摘出,大鼠PLN存有变异,操作不如小鼠方便,建议C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠可作为PLNA的首选敏感动物。在此基础上,利用工具药D-pen成功构建了BALB/c小鼠RA-PLNA模型。应用这两种模型进行下面的SHLI实验研究。2直接腘窝淋巴结试验研究注射用双黄连的致敏性雌性C57BL/6J小鼠随机分为空白对照(Veh)组、PB组(1 mg／只)、HgCl2组(50μg／只)和D-pen组(2 mg／只)、SHLI亻氐剂量组(L组,1 mg／只)和高剂量组(H组,5 mg／只),每组10只。小鼠一侧足趾部皮下给予受试物,第7d天处死动物,摘取两侧PLN,称重,计算WI；每组将4只小鼠的PLN以4%中性多聚甲醛固定用于病理学检查,其余6只制备单细胞悬液,计算CI。比较SHLI和致敏物引起的PLN反应,探讨SHLI的致敏潜能。结果表明：H组WI、CI较Veh组升高(P<0.05),WI>2和CI>5。病理检查,PLN体积变大,生发中心明显,HEV横断面增多。结果发现高剂量SHLI可诱导C57BL/6J小鼠产生明显的PLN反应,提示它具有一定的致敏潜能。但诱导PLN阳性反应需要较高的剂量,表明可能是SHLI中的微量成分发挥作用,这提示我们下一步需要对SHLI含有的不同成分进行研究,以确定致敏原存在的范围。此外,d-PLNA并未能揭示SHLI诱导PLNA反应的确切机制,这有待于下一步的RA-PLNA研究证实。3直接胭窝淋巴结试验研究药典工艺制备注射用双黄连及其精制品的致敏性按照药典经典工艺制备SHLI及其中间提取物,并用大孔树脂对其进行精制,共获得10个样品。BALB/c小鼠随机分组,右侧后肢足趾部酒精消毒,用胰岛素注射器或1 ml注射器皮下注射已知致敏物D-pen、供试品、以溶媒为阴性对照。小鼠给药体积均为50μl；利用d-PLNA研究5 mg／只剂量时的反应；对5mg／只出现PLNA阳性反应的样品,降低剂量为2.5mg／只给药；阴性反应的样品则提高剂量为10mg／只进行给药,以研究剂量-效应关系。结果发现,按药典原工艺制备的SHLI在高剂量下获得阳性反应,精制品PLNA反应降低,提示现有SHLI的药典工艺标准需要改进。另外,精制品水溶性较好,即使提高剂量也不易诱导PLNA阳性反应,表明有害物质可能是水溶性较差的成分,提示我们研究SHLI的致敏成分需用新方法分离提取三味药材的成分。4直接胭窝淋巴结试验研究新工艺注射用双黄连有效组分的致敏性利用d-PLNA研究采用新工艺提取制备的16个样品的致敏潜能。BALB/c小鼠随机分组,右侧后肢足趾部酒精消毒,用胰岛素注射器皮下注射。给药体积均为50μl；给药剂量均为10 mg／只；难溶于0.9%生理盐水的组分,先以10μl／只的纯DMSO溶解,然后再用0.9%生理盐水稀释为相应的浓度后给药。对出现PLNA阳性反应的化合物,进一步降低至5 mg／只、2.5 mg／只或0.25mg／只的剂量给药,直至发现无反应剂量,以研究剂量-效应关系。7／16个组分在10 mg／只出现明显的PLNA反应,提示这些部位中可能存有有害成分。引起PLNA阳性反应的组分分布于三种药材的提取物中,其中来源于双花提取物的2种,连翘提取物3种,黄芩提取物2种,说明有害成分在三种原药材中均可能存在。降低剂量至2.5 mg／只时阳性反应消失。表明反应存在剂量-效应关系,可对这些成分进一步提纯、分离其中的有害成分。但为了排除非特异性炎症刺激导致的d-PLNA假阳性反应,尚需进一步通过机制研究才能最终确定这些成分的致敏性。5报告抗原胭窝淋巴结试验研究注射用双黄连的致敏性本研究将高、低剂量的双黄连分别与TNP-OVA或TNP-Ficoll一起注射给BALB/c小鼠,利用RA-PLNA结合流式细胞术检测了SHLI的致敏机制。研究结果发现高剂量SHLI和两种报告抗原一起注射可以升高WI或CI,但阳性反应的程度并没有比单独注射高剂量SHLI时显著增加,表明注射报告抗原对高剂量SHLI诱导的PLNA反应没有显著影响；高剂量SHLI和TNP-OVA一起注射时,可明显增加TNP特异性AFC的数量,但与TNP-Ficoll一起注射或低剂量SHLI与二者一起注射时则未能增加AFC的数量；表明高剂量的SHLI提供了共刺激辅助性信号,导致了炎症刺激,降低剂量时则致炎作用消失。流式细胞术检测也发现高剂量SHLI与TNP-OVA一起可升高PLN中巨噬细胞的数量,提示了SHLI可激活体内的巨噬细胞,后者释放的细胞因子对促进炎症的发展具有重要的作用；但是SHLI在体内不会形成新的抗原表位,不能激活特异性T细胞,表明SHLI本身不具有致敏潜能,不会诱发抗原抗体特异性的免疫应答反应。所以,SHLI的成分本身不能直接诱导BALB/c小鼠产生IgE介导的超敏反应,即不具有致敏性。这与我们实验室另一研究小组的结论相一致,他们认为SHLI导致的急性过敏反应主要为类过敏反应。6注射用双黄连有效单体成分的致敏性研究6.1直接腘窝淋巴结试验研究绿原酸、黄芩苷和连翘苷的致敏性d-PLNA预测单一成分LMWC致敏性的特异性和准确性已被多家实验室证实,但对于其预测成份复杂TCMI致敏潜能的有效性尚未得到验证。因此,利用d-PLNA检测SHLI有效单体成份的致敏性,其结果应该更准确可靠。CGA、黄芩苷和连翘苷分别是SHLI三种原料药金银花、黄芩和连翘的主要成分。多数人认为他们是发挥药效作用的物质基础,但亦有些研究认为他们与注射用双黄连ADR有关。故本实验首先利用d-PLNA检测了CGA、黄芩苷和连翘苷的致敏潜能。实验结果发现,CGA、黄芩苷和连翘苷在1mg／只的剂量下,均未能诱导d-PLNA阳性反应,提示这些主要成分不具致敏性。6.2报告抗原胭窝淋巴结试验研究绿原酸的致敏性CGA广泛分布在各种植物中,人们经常接触到CGA,但现在还不清楚暴露于CGA是否可以诱导产生超敏反应。许多研究者高度怀疑CGA是一种半抗原,但是本研究d-PLNA实验结果不支持这种结论。为进一步检测CGA的致敏潜能,并验证d-PLNA检测CGA,黄芩苷和连翘苷实验结果是否准确可靠,本研究以CGA为代表,利用流式细胞术和RA-PLNA进一步研究了CGA的致敏性。研究结果表明,CGA对BALB/c小鼠PLN细胞表型、激活标志物没有影响。RA-PLNA检测发现,无论与TNP-OVA还是与TNP-Ficoll一起注射,CGA均不能诱导TNP特异性AFCs形成,这表明CGA对BALB/c小鼠不具有致敏潜能。结果证实了d-PLNA和RA-PLNA结果一致。提示移除TCMI中的CGA或许不会显著降低其不良反应的发生,这或许有助于消除一些研究者对绿原酸全身暴露时安全性的担忧。综上,本研究在国内首次成功建立了d-PLNA和RA-PLNA模型,并将之用于SHLI的致敏性研究；确认BALB/c小鼠和C57BL/6J小鼠为PLNA的首选敏感动物；研究结果证实,d-PLNA和RA-PLNA可用于SHLI及其有效组分或单体成分的致敏性研究；大剂量SHLI对小鼠具有辅助性炎症刺激作用,但不能激活抗原特异性的T淋巴细胞,表明SHLI的成分本身不能直接刺激BALB/c小鼠产生IgE介导的超敏反应,即不具有致敏性,提示IgE介导的超敏反应不是SHLI相关不良反应的主要发生机制,非抗原-抗体反应机制在其不良反应的发生、发展中起主导作用；这从另一个方面支持了我们实验室另一研究小组的结论：他们认为类过敏反应是SHLI临床不良反应发生的主要类型,SHLI直接刺激嗜碱性粒细胞或肥大细胞释放组胺等活性物质是其的主要机制。

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