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利用TaqMan实时荧光PCR技术检测两种植物病毒CMLV和PRMV的研究

作　者: 凌薇
导　师: 高必达
学　校: 湖南农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: recombination probe sensitive detection
分类号: R450
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

Plant virus is a kind of the serious plant pathogens. In this research, we designed two TaqMan probes for real-time PCR to detect the pathogens of the diseases, Cherry mottle leaf and Peach rosette mosaic respectively. And here is the effect:1) Cherry mottle leaf virus (CMLV) is one of the most important diseases on cherry in South America. In this research, we successfully synthesized the sequences of CMLV 6741～7322 nt genes (Genbank AF170028.1) and constructed positive standard plasmids of this nucleic fragment on the vector. According to the result of the real-time PCR,23 copies/μL of the plasmid was detected as the detection limit of the real-time PCR. And the inhibiting substance in cherry is little effect the detection.2) Peach rosette mosaic virus (PRMV), the cause agent of Vitis labrusca, Prunus persica, Vitis vinifera and many other cultivars of grapevine, is a quarantine pest in EPPO Al list. In this research, we successfully synthesized the sequences of PRMV 988～1755 nt genes (Genbank AF016626) and constructed positive standard plasmids of this fragment on the vector. The sensitivity detection of the real-time RT-PCR shows that,37 copies/μL of the RNA was detected as the detection limit, which is 100×more sensitive than RT-PCR.Finally, The FQ-PCR in this research could detection the CMLV and PRMV sensitively and rapidly. The methods are significant for the detection and prevention of these two viruses.

全文目录

Abstract  4-8
第一章前言  8-23
  1 植物病害诊断检测的一般程序  8-11
  2 植物病原菌传统检测技术  11-14
    2.1 柯赫氏法则  11
    2.2 植物病害症状诊断  11
    2.3 过敏性坏死反应  11-12
    2.4 血清学检测技术  12-14
      2.4.1 免疫吸附电镜技术  12-13
      2.4.2 酶联免疫吸附测定  13
      2.4.3 斑点免疫结合测定  13-14
      2.4.4 免疫组化技术  14
      2.4.5 其他血清学方法  14
  3 分子生物学检测  14-23
    3.1 实时荧光定量PCR  15-19
      3.1.1 扩增曲线  16
      3.1.2 荧光阈值  16-17
      3.1.3 标准曲线  17
      3.1.4 扩增效率  17-18
      3.1.5 TaqMan探针法  18-19
    3.2 实时荧光定量PCR与传统PCR相比较的特点及优势  19-20
    3.3 核酸杂交技术  20-21
    3.4 基因芯片  21-22
    3.4 其他分子生物学检测技术  22-23
第二章樱桃叶斑驳病毒和桃丛簇花叶病毒实时荧光PCR检测技术的研究  23-45
  第一部分  23-35
    1 樱桃叶斑驳病毒  23-26
      1.1 樱桃叶斑驳病毒概述  23
      1.2 CMLV的症状  23-25
      1.3 CMLV的分布与传播  25
      1.4 血清学技术检测CMLV  25
      1.5 核酸技术检测CMLV  25-26
    2 实时荧光PCR检测樱桃叶斑驳病毒  26-35
      2.1 材料与方法  26-32
        2.1.1 材料  27
        2.1.2 方法  27-32
      2.2 结果与分析  32-35
        2.2.1 质粒标准品序列分析  32
        2.2.2 普通PCR及FQ-PCR的检测灵敏度比较  32-33
        2.2.3 FQ-PCR特异性检测结果  33-34
        2.2.4 FQ-PCR标准曲线的构建  34
        2.2.5 FQ-PCR检测模拟样品  34-35
  第二部分  35-45
    1 桃丛簇花叶病毒  35-37
      1.1 桃丛簇花叶病毒概述  35
      1.2 PRMV的症状  35-37
      1.3 PRMV的分布与传播  37
      1.4 PRMV检测技术  37
    2 实时荧光PCR检测桃丛簇花叶病毒  37-45
      2.1 材料与方法  38-41
        2.1.1 材料  38
        2.1.2 方法  38-41
      2.2 结果  41-45
        2.2.1 FQ-PCR灵敏度检测及标准曲线的构建  41-42
        2.2.2 体外转录分析  42
        2.2.3 RT-PCR检测灵敏度  42-43
        2.2.4 实时荧光RT-PCR灵敏度检测及标准曲线的构建  43-45
第三章讨论  45-47
  1 樱桃叶斑驳病毒  45
  2 桃丛簇花叶病毒  45-47
第四章全文总结  47-48
  1 实时荧光PCR技术检测樱桃叶斑驳病毒  47
  2 实时荧光PCR技术检测桃丛簇花叶病毒  47-48
参考文献  48-56
致谢  56-57
作者简介  57

利用TaqMan实时荧光PCR技术检测两种植物病毒CMLV和PRMV的研究

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