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新城疫病毒F蛋白-Ii嵌合体与MHC分子结合特性的研究

作　者: 叶红
导　师: 余为一
学　校: 安徽农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 鸡恒定链 MHCⅡ MHCⅠ 共定位低聚化 NDV-F
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
下　载: 81次
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内容摘要

在免疫系统中,主要组织相容性复合物（Major histocompatibility complex,MHC）Ⅰ、Ⅱ分子作为肽受体,具有提呈抗原肽的功能。恒定链（Invariant Chain,Ii）是一种非多态性Ⅱ型跨膜糖蛋白,它是MHCⅡ分子生物合成及MHCⅡ分子结合外源性抗原肽过程中重要的分子伴侣。研究表明,在内质网中Ii辅助MHCⅡ亚单位初始折叠和低聚化,并与MHCⅡ分子组装成（αβIi）₃九聚体,同时Ii的CLIP区（the class-Ⅱassociated Iichain peptide）即第81-104位氨基酸片段,占据MHCⅡ的抗原结合凹槽,有效屏蔽了MHCⅡ类分子在内质网中与内源性抗原肽结合。细胞中缺乏Ii会导致MHCⅡα链和β链不能正确折叠,从而被较长时间滞留于内质网中。迄今为止,Ii与MHCⅡ分子相互关系的研究多集中在哺乳动物,有关禽类的研究还未见报导。从推测的氨基酸序列分析看,人、小鼠、大鼠的CLIP区（尤其是91-99aa:MRMATPLLM）是完全保守的,但这种高度的保守性未出现包括禽类在内的其他物种中。对于鸡Ii与鸡Ⅱ类抗原递呈分子亚单位在细胞中的定位如何,Ii链能否与MHCⅡα和MHCⅡβ的单链聚合,Ii链中的CLIP区在聚合中起何作用,外源性抗原肽替代CLIP后,Ii链是否还能与MHCⅡ链聚合?为了探讨这些问题,我们构建了表达红色荧光蛋白（Red Fluorescent Protein,RFP）的鸡Ⅱ类抗原递呈分子亚单位即MHCⅡα链和β链的真核表达载体和表达增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluores cenceProtein,EGFP）的Ii真核表达载体,使用瞬时表达系统,检测Ii与单个MHCⅡ亚单位在COS-7细胞中的表达和定位,并通过免疫共沉淀进一步研究它们之间的相互关系。研究表明,带有荧光蛋白的融合蛋白保持了目的蛋白（Ii、MHCⅡα和MHCⅡβ）的活性和标记蛋白（GFP和RFP）的特性且定位于细胞的内膜系统;其次鸡Ii链与单链MHCⅡα或MHCⅡβ之间存在细胞内的共定位,并且它们之间能够形成复合体,在这一过程中CLIP区担当关键角色。为了探索研制高效的核酸疫苗,我们将以新城疫病毒的F₃₄₃抗原表位基因（aa327-359）替换鸡Ii链CLIP编码基因构建的Ii嵌合体分别与单个MHCⅡ亚单位共转染COS-7细胞,通过荧光显微镜观察Ii嵌合体改变了抗原表位在细胞中的定位,并且通过免疫共沉淀证实用NDV的F₃₄₃抗原肽取代CLIP区的Ii嵌合体保持与单链MHCⅡα或MHCⅡβ聚合。这些结果提示,只要保持Ii分子基本的空间结构,Ii链就能与MHCⅡα或MHCⅡβ链形成聚合体。因此,在新型高效基因疫苗的设计中,Ii可以充当抗原肽潜在的运输载体将抗原肽靶向性地传递到MHCⅡ递呈抗原分子的路径中。病毒性抗原作为内源性抗原由MHCⅠ类分子呈递,而Ii分子作为MHCⅡ分子的伴侣蛋白主要协助递呈外源性抗原。MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子的合成均起源于内质网,它们在细胞中的分选则发生在高尔基体的反面膜囊,MHCⅠ类分子通过膜泡运输离开高尔基体到达细胞表面,MHCⅡ类分子则进一步到达溶酶体。MHCⅠ与MHCⅡ所走路线的不同可能与Ii的引导有关。为了了解鸡的Ii分子与MHCⅠ类分子之间的关系,本文还探讨了它们之间是否存在相互作用。为此,我们首先获得了鸡MHCⅠ分子亚单位的基因,并进一步构建了相应的原核表达质粒,用pET-32a和Rosseta菌组合表达带有信号肽的MHCⅠα、MHCⅠβ_2m。其次,我们构建了能表达红色荧光蛋白的鸡MHCⅠ类抗原递呈分子亚单位的真核表达载体,并与能表达增强型绿色荧光蛋白的Ii真核表达载体,使用瞬时表达系统共转染COS-7,荧光显微镜检测与免疫共沉淀的结果表明,单个的鸡MHCⅠα重链或β_2m轻链均不能与鸡Ii有效结合,Ii分子要求与完整的MHCⅠ分子结合才能形成复合体。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-10
图表目录  10-12
缩略词表  12-13
第一篇文献综述  13-37
  1 Ii研究概况  13-31
    1.1 Ii分子结构  13-15
    1.2 Ii功能  15-22
      1.2.1 Ii在抗原提呈中的作用  15-18
      1.2.2 Ii在B细胞成熟中的作用  18-21
      1.2.3 Ii与疾病的关系  21-22
    1.3 由Ii介导的MHC分子装配的相关研究进展  22-28
      1.3.1 Ii介导MHC Ⅱ分子的装配  22-27
      1.3.2 Ii与MHC Ⅰ分子的相互作用  27-28
    1.4 Ii的应用  28-31
      1.4.1 Ii-抗原融合基因  28-29
      1.4.2 以抗原表位替代CLIP构建的Ii-抗原表位嵌合体  29
      1.4.3 外源性地增加CLIP区对免疫应答的调节  29
      1.4.4 Ii-key hybrid  29-30
      1.4.5 Ii的免疫抑制  30-31
  2 新城疫病毒疫苗的研究进展  31-34
    2.1 NDV分子生物学特征及其致病的分子基础  31-32
    2.2 F蛋白的抗原表位  32-33
    2.3 F蛋白基因工程疫苗的研究现状  33
    2.4 F蛋白表位疫苗的研究进展  33-34
  3 国内外禽类Ii研究现状  34-35
  4 问题与展望  35-37
引言  37-39
第二篇研究内容  39-109
  第一章新城疫病毒F-Ii嵌合体与MHC Ⅱ类分子亚单位的细胞定位及聚合特性研究  39-79
    1 材料和方法  40-57
      1.1 实验材料  40-44
      1.2 实验方法  44-57
    2 结果与分析  57-75
      2.1 鸡MHC Ⅱ类抗原递呈分子亚单位与Ii的信号肽分析  57-61
      2.2 鸡Ii及MHCⅡ分子结构与功能的初步分析  61-64
      2.3 真核表达载体的构建与鉴定  64-66
      2.4 鸡Ii与Ⅱ抗原递呈分子亚单位基因在COS-7细胞中的表达及定位特点  66-67
      2.5 鸡Ii与Ⅱ抗原递呈分子亚单位在COS-7细胞中的共定位  67-68
      2.6 鸡Ii与Ⅱ类抗原递呈分子亚单位的聚合作用特性  68-71
      2.7 替代CLIP区的鸡Ii-F_(343)嵌合体与Ⅱ类抗原递呈分子亚单位的相互作用  71-73
      2.8 小鼠Ii与鸡Ⅱ抗原递呈分子亚单位在COS-7细胞中的共定位  73-75
    3 讨论  75-78
    4 结论  78-79
  第二章鸡MHC Ⅰ类分子亚单位的克隆与原核表达  79-99
    1 材料与方法  79-85
      1.1 材料  79-80
      1.2 实验方法  80-85
    2 结果与分析  85-96
      2.1 鸡MHC Ⅰα和MHC Ⅰβ_(2m)基因的克隆与鉴定  85-90
      2.2 带信号肽的鸡MHC Ⅰα和MHC Ⅰβ_(2m)亚单位的原核表达  90-96
    3 讨论  96-98
    4 结论  98-99
  第三章鸡Ⅰ类抗原递呈分子亚单位与鸡恒定链在COS-7中的定位及相互关系研究  99-109
    1 材料和方法  99-102
      1.1 实验材料  99-100
      1.2 实验方法  100-102
    2 结果与分析  102-106
      2.1 真核表达载体的选择、构建与鉴定  102
      2.2 鸡Ⅰ抗原递呈分子亚单位在COS-7细胞中的表达与定位  102-103
      2.3 COS-7细胞中鸡Ⅰ抗原递呈分子α和β_(2m)亚单位与鸡Ii的共定位  103-104
      2.4 COS-7细胞中鸡Ii与MHC Ⅰα和MHC Ⅰβ_(2m)的相互作用研究  104-105
      2.5 鸡与哺乳动物MHC Ⅰ分子α链成熟肽的氨基酸序列同源性比较  105-106
    3 讨论  106-108
    4 结论  108-109
参考文献  109-121
致谢  121-123
作者简介  123
读博士学位期间发表和待发表的学术论文  123-124

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