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BRL37344对人网膜原代脂肪细胞UCP1和GLUT4表达的影响

作　者: 张艳红
导　师: 班博
学　校: 天津医科大学
专　业: 内科学
关键词: β3受体激动剂 BRL37344 人网膜脂肪细胞原代培养解耦联蛋白1 葡萄糖转运体4
分类号: R589.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：肥胖症是由于机体能量摄入大于消耗,过多能量在体内蓄积而导致的一种病理状态,是胰岛素抵抗、2型糖尿病、动脉粥样硬化和代谢综合征等疾病的重要危险因素。近年来针对肥胖症和脂肪细胞代谢方面的研究引起越来越多的关注,选择性β3-受体激动剂因其潜在的抗肥胖和抗糖尿病作用成为这一领域的研究热点。本实验以人网膜前脂肪细胞为研究对象,探讨原代细胞培养的方法并建立网膜脂肪细胞培养模型,观察选择性β3受体激动剂 BRL37344对人网膜原代脂肪细胞解耦联蛋白1(uncoupling protein 1, UCP1)、葡萄糖转运体4(glucose transporter4, GLUT4) mRNA及蛋白表达水平的影响。方法：选取择期开腹手术患者26例,其中16例用于研究人网膜前脂肪细胞培养模型的建立,另外10例用于药物干预研究。无菌条件下取其新鲜网膜脂肪组织10-20g,置于盛有基础培养基的无菌离心管中,半小时内低温转移至细胞室。采用胶原酶消化法获取原代前脂肪细胞,诱导其分化为成熟的脂肪细胞,采用细胞形态学观察和油红O染色法鉴定细胞。脂肪细胞分化成熟后,用不同浓度的BRL37344 (10-9mol/L、10-7mol/L)干预脂肪细胞24h,干预后收获相应细胞,并分别提取细胞总RNA和总蛋白,应用RT-PCR检测UCPl和GLUT4 mRNA的表达水平,用Western blot方法检测UCP1和GLUT4蛋白的表达水平。数据用均数±标准差(x±s)表示,统计方法采用单因素方差分析(One-way ANOVA),P<0.05为差别有统计学意义。结果：1.成功培养出人网膜前脂肪细胞,并诱导分化为成熟的脂肪细胞。接种24小时后,前脂肪细胞基本贴壁,但体积较小,初为类圆形,随后变为长梭形或不规则形,2-3天增长迅速,可达70%-80%汇合。在分化培养基的作用下,分化5-6天后即可看到细小脂滴,8-10天后可观察较多脂滴积聚,呈现葡萄串状,将细胞核挤至细胞一侧,分化15天左右多数脂滴逐渐融合变成少量较大脂滴,此后细胞基质蛋白表达减少,细胞贴壁能力下降,易受震动及其他机械力的影响,容易被洗脱。2.经油红O染色鉴定,脂肪细胞细胞纯度达95%。3.采用不同浓度BRL37344干预成熟脂肪细胞,各干预组UCP1、GLUT4mRNA和蛋白的表达水平均高于对照组,增高水平呈现剂量依赖性。结论：1.本实验借鉴国内外学者的研究方法并在此基础上做适应性调整,成功培养出人网膜前脂肪细胞,并诱导其分化成熟,经油红O染色鉴定为脂肪细胞,细胞纯度达95%。分离出的前脂肪细胞具有以下3个主要特征：①取自脂肪组织,分离培养的细胞形态为梭形,胞质内无脂肪滴,②增殖迅速,与成纤维细胞在倍增时间上接近,③在形成单层汇合后,通过测定脂肪细胞特异性酶和观察细胞内出现脂质聚集来证实可转化为成熟脂肪细胞。前脂肪细胞的体外培养技术为研究其生长、分化及内分泌功能提供了较好的实验平台。2.选择性β3受体激动剂BRL37344可促进人网膜脂肪细胞UCP1及GLUT4的表达,进而增加机体产热和葡萄糖转运,改善机体能量蓄积和糖代谢异常,从而为肥胖、糖尿病及相关疾病的诊治提供了新的研究思路。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-11
缩略语/符号说明  11-13
前言  13-16
  研究现状、成果  13-14
  研究目的  14-15
  研究方法  15-16
一、网膜脂肪细胞培养模型的建立  16-28
  1.1 对象和方法  16-21
    1.1.1 研究对象  16-17
    1.1.2 试剂及耗材  17-18
    1.1.3 实验仪器  18
    1.1.4 缓冲液及培养基的配制  18-19
    1.1.5 人网膜前脂肪细胞的原代培养-胶原酶消化法  19-21
  1.2 结果  21-22
    1.2.1 脂肪细胞的形态学观察  21
    1.2.2 脂肪细胞的鉴定  21-22
  1.3 讨论  22-27
    1.3.1 细胞培养技术  22-23
    1.3.2 棕色脂肪组织和白色脂肪组织  23-24
    1.3.3 棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞  24
    1.3.4 脂肪细胞培养  24-27
  1.4 小结  27-28
二、BRL37344对网膜脂肪细胞UCP1和GLUT4表达的影响  28-43
  2.1 对象和方法  29-37
    2.1.1 研究对象  29
    2.1.2 试剂及耗材  29-31
    2.1.3 实验仪器  31
    2.1.4 药物干预  31-32
    2.1.5 药物干预后脂肪细胞UCP1和GLUT4 mRNA的表达  32-35
    2.1.6 药物干预后脂肪细胞UCP1和GLUT4蛋白的表达  35-37
    2.1.7 统计学处理  37
  2.2 结果  37-39
    2.2.1 琼脂糖凝胶电泳结果  37-38
    2.2.2 X线胶片成像结果  38
    2.2.3 统计分析结果  38-39
  2.3 讨论  39-42
    2.3.1 β3-AR概述  39-40
    2.3.2 β3-ARα的药理作用  40-41
    2.3.3 BRL37344的研究现状  41-42
  2.4 小结  42-43
结论  43-44
参考文献  44-48
发表论文和参加科研情况说明  48-49
附录  49-53
综述 β3受体和β3受体激动剂的研究进展  53-63
  综述参考文献  60-63
致谢  63

BRL37344对人网膜原代脂肪细胞UCP1和GLUT4表达的影响

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