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无抗性标记的人白血病抑制因子打靶载体的构建及表达研究

作　者: 王韵斐
导　师: 曹斌云
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 人白血病抑制因子 山羊β-酪蛋白 同源重组 乳腺生物反应器
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


动物乳腺生物反应器是指利用动物乳腺特异性乳蛋白基因的调控序列构建表达载体,来生产转基因动物,指导外源基因在乳腺中特异性高效表达,并能从乳汁中获取重组蛋白的一种生物反应器。而体细胞基因打靶—核移植技术由于能够将外源基因定点整合到受体细胞基因组中,克服随机整合带来的位置效应及多拷贝插入问题,实现外源基因在动物乳腺中特异性高效表达等优势,目前已成为制备动物乳腺生物反应器的主要技术选择。本研究就是利用基因打靶技术将人白血病抑制因子(hLIF)基因定位整合至奶山羊β-酪蛋白基因座,并验证hLIF基因在奶山羊乳腺上皮细胞中的表达,以期为获得能特异性高效表达hLIF基因的乳腺生物反应器打下基础。合成一段两端带有同向LoxP序列的多克隆位点序列,并将其插入到骨架载体pBluescript_SK+中,得到载体pLoxP。然后将克隆得到的山羊β-酪蛋白5′和3′端同源臂,正向筛选标记基因neo和负向筛选标记基因tk插入到载体pLoxP中,得到山羊β-酪蛋白基因座通用打靶载体pLoxP-NT53。再将hLIF基因克隆到载体pLoxP-NT53中从而得到hLIF基因打靶载体pLoxP-NT53L。其中hLIF基因位于山羊β-酪蛋白基因第七外显子下游,neo基因位于两段同向LoxP序列之间,tk基因位于山羊β-酪蛋白3′同源臂外侧。采取泌乳期奶山羊乳腺组织,利用组织块贴壁培养法培养原代奶山羊乳腺上皮细胞。经细胞传代纯化后,将经SwaⅠ酶切线性化后的重组质粒pLoxP-NT53L通过脂质体转染整合至奶山羊乳腺上皮细胞基因组中,利用G418和CANC对转染细胞进行双重抗性筛选,并对获得的抗性细胞克隆进行PCR、实时定量PCR和Western blotting检测,以验证hLIF基因在奶山羊乳腺上皮细胞中的表达情况。酶切和测序分析结果显示,本试验成功构建了hLIF基因打靶载体pLoxP-NT53L。对经筛选获得的抗性细胞克隆进行hLIF基因PCR和实时定量PCR检测,得到14个阳性细胞克隆。将阳性细胞克隆进行激素诱导后利用山羊β-酪蛋白基因启动子指导hLIF表达,进行Western blotting检测,结果有2个阳性克隆成功表达了hLIF蛋白。表明hLIF基因已经成功整合至山羊β-酪蛋白基因座中,并能在奶山羊乳腺上皮细胞中特异性表达hLIF蛋白。从而为无抗性标记的转hLIF基因奶山羊新品种的培育奠定了基础。

全文目录


摘要  6-7
ABSTRACT  7-11
文献综述  11-19
  第一章 利用转基因动物生产药用蛋白的研究进展  11-14
    1.1 利用动物生产药用蛋白的历史  11
    1.2 转基因动物体系的分类  11
    1.3 生产转基因动物的方法  11-12
    1.4 转基因产物表达的优化  12
    1.5 重组蛋白在动物乳汁中的其他作用  12-13
    1.6 结论和展望  13-14
  第二章 动物乳腺生物反应器的研究进展  14-17
    2.1 动物乳腺生物反应器的定义  14
    2.2 利用乳腺生物反应器生产重要特效药用蛋白的研究进展  14-15
    2.3 利用转基因技术构建乳腺生物反应器生产重要特效药用蛋白的优势  15
    2.4 利用乳腺生物反应器生产重要药用蛋白对保障人类健康的紧迫性  15
    2.5 利用乳腺生物反应器生产白血病抑制因子的现实意义  15-17
  第三章 基因打靶技术  17-19
    3.1 基因打靶的定义  17
    3.2 基因打靶技术的国内外研究现状  17
    3.3 条件重组体系与基因打靶结合的技术优势  17-18
    3.4 基因打靶技术的发展前景  18-19
试验研究  19-42
  第四章 hLIF 基因打靶载体的构建及鉴定  19-31
    4.1 引言  19-20
    4.2 材料与方法  20-25
      4.2.1 材料  20-21
      4.2.2 方法  21-25
    4.3 结果与分析  25-29
      4.3.1 hLIF 基因的扩增结果  25
      4.3.2 山羊β-酪蛋白基因5′和3′端同源臂的扩增结果  25-26
      4.3.3 neo 和tk 基因的扩增结果  26-27
      4.3.4 山羊β-酪蛋白基因座通用打靶载体pLoxP-NT53 的酶切鉴定  27
      4.3.5 hLIF 基因打靶载体pLoxP-NT53L 的酶切鉴定  27-28
      4.3.6 Cre/LoxP 系统有效性的检测结果  28-29
    4.4 讨论  29-30
    4.5 小结  30-31
  第五章 奶山羊乳腺上皮细胞的培养、转染及阳性克隆的筛选  31-38
    5.1 引言  31
    5.2 材料与方法  31-33
      5.2.1 材料  31-32
      5.2.2 方法  32-33
    5.3 结果与分析  33-36
      5.3.1 奶山羊乳腺上皮细胞培养结果  33-34
      5.3.2 奶山羊乳腺上皮细胞抗性筛选浓度测定实验结果  34
      5.3.3 重组质粒转染奶山羊乳腺上皮细胞筛选结果  34-36
    5.4 讨论  36-37
    5.5 小结  37-38
  第六章 阳性克隆的检测  38-42
    6.1 引言  38
    6.2 材料与方法  38-39
      6.2.1 材料  38
      6.2.2 方法  38-39
    6.3 结果与分析  39-41
      6.3.1 阳性克隆的PCR 检测结果  39-40
      6.3.2 阳性克隆的实时定量PCR 检测结果  40
      6.3.3 阳性克隆的hLIF 蛋白Western blotting 检测结果  40-41
    6.4 讨论  41
    6.5 小结  41-42
结论、创新点及不足之处  42-43
参考文献  43-48
附录  48-55
致谢  55-56
作者简介  56

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病
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