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肝癌细胞系和肝癌组织中SOX7 mRNA的表达及其SOX7 DNA的甲基化状态

作　者: 翟倩倩
导　师: 吕全军；鲁凤民
学　校: 郑州大学
专　业: 营养与食品卫生
关键词: 肝癌组织 SOX7 mRNA 肝癌细胞系实时定量PCR Wnt信号通路
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是全世界范围内最高发的恶性肿瘤之一,是原发性肝癌的主要类型,占其85%-90%。我国是肝癌的高发区,并且发病率有日渐升高之势。肝细胞癌发生最常见的病因包括HBV、HCV或两者的慢性感染,酗酒和摄入高含量黄曲霉素。肝细胞癌的发生是个长期的、复杂的、多因素相互作用并共同参与的连续过程。其分子生物学机制尚不完全明确。研究发现,Wnt信号通路在成人组织中可能异常活化,从而参与多种肿瘤的发生发展过程。SOX基因家族是Wnt信号通路末端的转录调控因子,是该通路发生不同水平激活的最后共同通道,可通过不同的调节机制影响Wnt通路靶基因的转录和表达,在肿瘤的发生发展中起重要作用。SOX7是SOX家族F亚组的关键成员之一,通过与转录因子TCF/LEF结合的方式抑制下游靶基因转录。已有研究报道,SOX7的异常表达与许多人类肿瘤的发生、发展有关。李正国等发现在48%(10/21)的前列腺癌组织和11种前列腺癌细胞系中SOX7 mRNA表达水平下调。张瑜等人指出在80%(16/20)结肠癌组织和9种结肠癌细胞系中SOX7均低表达。SOX7在原发性乳腺癌、原发性肾癌和原发性肺癌中的mRNA表达水平也明显下调。但是SOX7与HCC关系的研究却很少。目的1.研究SOX7在肝癌细胞系,HCC癌组织和匹配癌旁组织中的mRNA表达水平及其与临床病理参数的关系。2.研究SOX7 mRNA低表达肝癌细胞系和肝癌组织中SOX7 DNA启动子区的甲基化状态。方法1肝癌细胞系北京大学病原微生物学系提供的肝癌细胞系：HepG2,Snu449, SMMC-7721, Snu182, SK-Hep-1, Huh-1, Huh-7, Plc-PRF-5和Hep3B。2研究对象的选择、组织样本的采集及临床病理等相关因素的收集选取2009年5月至2010年4月在河南省肿瘤医院就医的肝癌患者作为本研究的研究对象,采集患者手术后肝癌组织及其匹配的癌旁组织标本40对。所有标本均经病理学鉴定。标本离体后放入-80℃冰箱中保存。收集患者的年龄,门静脉癌栓,肝内播散,肝硬化程度,微血管浸润,肝外转移,肿瘤大小,肿瘤部位等相关因素的资料。3细胞、组织中SOX7 mRNA表达水平的测定采用荧光定量PCR方法测定肝癌患者癌组织及匹配的癌旁组织中SOX7基因mRNA的表达水平,以HMBS作为内参基因。通过测定样本中目的基因模板的Ct值(循环阈值)来反映模板的含量。对每一个样本,用△Ct(CtsOX7-CtHMBs)值表示目的基因与内参基因HMBS间Ct的差值,2-Δct反应样本SOX7 mRNA的表达水平。4样本中SOX7启动子区甲基化水平的测定通过双酶切定量PCR检测Hep3B, SK-Hep-1, Plc-PRF-5, Snu449, Snul82, HepG2, Huh-1和19例SOX7 mRNA低表达肝癌患者癌组织及其匹配的癌旁组织中SOX7甲基化水平。每一标本的HM≥10%定义为发生甲基化,0%<HM<10%定为非甲基化。5统计学分析运用SPSS16.0统计分析软件对数据进行分析。采用Wilcoxon符号秩和检验比较40例肝癌患者癌组织与癌旁组织中的SOX7基因mRNA表达水平,Fisher确切概率法分析表达与临床病理等相关因素的关系。以α=0.05作为检验水准。结果1荧光定量PCR结果1.1 SOX7基因在肝癌细胞系中的mRNA表达水平以正常肝组织中SOX7 mRNA的表达水平为基础值,SOX7 mRNA在HepG2, Snu449, Snu182, SMMC-7721, SK-Hep-1, Huh-1, Huh-7, Plc-PRF-5和Hep3B中的表达有显著的下调趋势。1.2 SOX7 mRNA在肝癌组织及匹配的癌旁组织中的表达水平荧光定量PCR结果显示,与匹配癌旁肝组织相比,在40例样品中,19例肝癌组织中出现SOX7 mRNA表达下调。统计分析表明,肝癌组织中SOX7 mRNA的表达水平低于癌旁组织中SOX7 mRNA的表达水平(z=-1.978,P<0.05)。1.3 SOX7 mRNA在肝癌组织中的表达水平与临床病理等相关因素之间的关系SOX7 mRNA的表达与肝癌患者的一些病理因素有关。大于45岁患者SOX7mRNA表达水平明显低于小于等于45岁年龄组患者的表达水平(χ2=7.866,P<0.05)；肿瘤临床分期越高,SOX7 mRNA表达水平越低(χ2=8.319,P<0.05)；而门静脉癌栓、肝内播散、肝硬化程度与SOX7 mRNA的表达水平无关。1.4定量PCR检测的甲基化结果结果显示,SOX7 DNA启动子区在4株肝癌细胞系Hep3B、SK-Hep-1、HepG2、Huh-1中发生了甲基化,而在SOX7 mRNA表达下调的19例肝癌组织中只发现3例有SOX7 DNA启动子区发生甲基化。结论1. SOX7 mRNA表达水平在肝癌细胞系比正常肝组织表达下调,在肝癌组织比匹配的癌旁组织表达下调。2. SOX7 mRNA表达水平与年龄、临床分期密切相关。3. SOX7 DNA启动子区在肝癌细胞系Hep3B、SK-Hep-1、HepG2、Huh-1发生甲基化,而在SOX7 mRNA表达下调的肝癌组织中发现SOX7 DNA启动子区甲基化现象并不明显。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-11
目录  11-14
图表索引  14-15
英文缩略词表  15-16
前言  16-18
第一部分肝癌细胞系和肝癌组织中SOX7基因mRNA的表达及其与临床病理参数的关系  18-36
  引言  18-19
  1 材料  19-24
    1.1 主要仪器设备  19-20
    1.2 耗材  20-21
    1.3 主要试剂  21-22
    1.4 试剂的配制  22-24
  2 方法  24-30
    2.1 研究对象的选择、组织标本的采集和临床病理等资料的收集  24
    2.2 肝癌细胞系  24
    2.3 采用Trizol试剂提取样品中的mRNA  24-25
    2.4 mRNA逆转录  25-26
    2.5 Real time-PCR检验逆转录的cDNA  26-27
    2.6 荧光定量PCR技术(Real-time fluorescent quantitative PCR)  27-28
    2.7 HMBS,SOX7引物设计  28
    2.8 样品cDNA中各目的基因的Real-time PCR检测  28-29
    2.9 统计学处理  29-30
  3 结果  30-33
    3.1 研究对象的基本情况  30
    3.2 mRNA提取结果  30
    3.3 逆转录效率检测结果  30-31
    3.4 荧光定量PCR结果  31-33
  4 讨论  33-35
  5 结论  35-36
第二部分 SOX7 mRNA异常表达的肝癌细胞系及肝癌组织中SOX7 DNA启动子区的甲基化状态检测  36-46
  引言  36-38
  1 对象与方法  38-41
    1.1 对象  38
    1.2 采用苯酚/氯仿法提取样品中的DNA  38-39
    1.3 方法  39-41
  2 结果  41-42
  3 讨论  42-45
  4 结论  45-46
参考文献  46-48
综述  48-64
  参考文献  59-64
个人简历及硕士期间学术论文发表情况  64-65
致谢  65

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