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肺癌干细胞的表面筛选标志分子和富集方法的研究

作　者: 月文科
导　师: 周清华
学　校: 天津医科大学
专　业: 外科学
关键词: 肺癌干细胞流式细胞术无血清培养顺铂诱导 CD133 CD24
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：本研究采用流式细胞术检测CD133、CD24、CD44和CD221在不同类型人肺癌细胞株中的表达,筛选可能的肺癌干细胞表面标志分子,采用无血清悬浮培养成球并顺铂诱导的方法富集肺癌细胞株中的肺癌干细胞,并检测筛选到的表面标志分子在其中的表达,以期获得能够有效分离肺癌干细胞的表面标志分子,为后续人肺癌肿瘤干细胞的筛选和功能研究奠定实验基础。方法：流式细胞术检测CD133、CD24、CD44和CD221在人肺腺癌细胞株A549、鳞癌细胞株YTMLC-9、具有相同遗传背景的人肺大细胞肺癌高转移潜能细胞株L9981和低转移潜能细胞株NL9980中的表达,筛选可能的肺癌干细胞标记分子；以L9981和A549为研究对象,经无血清悬浮培养并顺铂诱导L9981后,获得肺癌细胞球体。对含血清培养贴壁L9981细胞和无血清培养成球后的L9981细胞,通过显微镜下观察比较二者的生物学形态,应用Vi-cell细胞活力分析仪计数细胞并绘制生长曲线比较二者的增殖能力,通过Transwell实验研究它们的侵袭能力差异,并通过接种裸鼠观察二者在体内的成瘤性来研究肺癌细胞球体的生物学功能,验证其干性。同样方法鉴定A549的生物学功能。并进一步检测CD133和CD24在此肺癌干细胞样细胞亚群中的表达水平,以验证CD133和CD24作为可能的肺癌干细胞分选标记物的可行性。结果：1.流式单参数检测结果显示,CD221和CD44在A549、YTMLC-9、L9981和NL9980肺癌细胞株中表达水平较高,CD133和CD24在各肺癌细胞株中表达水平较低。流式双参数检测结果显示,CD133-CD24-、CD133-CD24+、CD221-CD24-、CD221+CD24在各细胞株中表达水平较高,CD133+CD24-、CD133+CD44+.CD221-CD24+、CD221+CD24+表达水平较低。CD221在A549和YTMLC-9细胞中表达水平无显著差异,而在具有不同转移潜能的大细胞肺癌细胞株L9981和NL9980中,在两者中的表达具有显著性差异(P<0.01)。2.A549细胞无血清悬浮培养成球性较差,而L9981成球显著。悬浮培养的L9981细胞于贴壁培养时比较,细胞生长成球较慢,最少需要1周才能大量生长。但细胞球一旦形成,其维持时间要长于贴壁培养的肿瘤细胞。L9981、A549细胞在经药物顺铂处理后,产生耐药性的细胞形态各异,大小不,体积明显增大,且透光性差3.与含血清贴壁培养的L9981和无血清悬浮培养并顺铂诱导L9981的倍增时间分别为(46.05±1.95)h和(33.00±1.44)h；贴壁A549和无血清悬浮培养并顺铂诱导A549的倍增时间分别为(54.28±1.41)h和(34.49±1.81)h；无血清悬浮培养并顺铂诱导L9981细胞的侵袭和成瘤能力分别为贴壁培养L9981细胞的12倍和20倍,具有显著性差异(P<0.05)；无血清悬浮培养并顺铂诱导A549细胞的侵袭能力为贴壁培养A549细胞的5倍,具有显著性差异(P<0.05)4.检测CD133+和CD24+在含血清贴壁培养细胞中的表达水平,在无血清悬浮培养并顺铂诱导处理细胞富集到的肺癌干细胞样细胞亚群中,CD133+的表达水平显著提高,而CD24+的表达水平显著降低,具有显著差异(P<0.05)；裸鼠体内成瘤后肿瘤组织病理活检证实为肺癌组织,免疫组化结果显示CD133在其中的表达水平为2%左右,CD24表达不显著。结论：1.初步预测CD133+CD24-、CD133-CD24+可能是非小细胞肺癌干细胞的表面免疫分子标记,至少是比较接近肺癌干细胞的标记。2.采用添加生长因子的无血清悬浮培养并顺铂诱导处理L9981和A549细胞,L9981培养后获得肺癌细胞球体效果显著。L9981球体细胞的细胞增殖能力、侵袭能力和成瘤能力均显著高于贴壁L9981细胞,有统计学意义(P<0.05)。A549成球性较差,无血清悬浮培养并顺铂诱导处理的A549细胞的细胞增殖能力、侵袭能力和成瘤能力均显著高于贴壁A549细胞,有统计学意义(P<0.05)。表明肺癌球体细胞中富含肺癌干细胞/肺癌干细胞样细胞。3.肺癌干细胞样细胞亚群中CD133+的表达水平显著提高,而CD24+的表达水平显著降低。提示CD133+CD24-可能为肺癌干细胞一个可能的表面标记分子,或是肺癌干细胞发展中某一阶段的表面标记分子。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-11
缩略语/符号说明  11-12
前言  12-19
  研究现状、成果  12-17
  研究目的、方法  17-19
一、CD133、CD24、CD44和CD221在非小细胞肺癌细胞株中表达水平的研究  19-39
  1.1 对象和方法  19-23
    1.1.1 材料  19
    1.1.2 主要试剂  19
    1.1.3 主要仪器设备  19-20
    1.1.4 主要试剂溶液的配制  20
    1.1.5 细胞培养  20-21
    1.1.6 单参数法检测CD分子的表达水平  21-22
    1.1.7 双参数法检测CD分子的表达水平  22
    1.1.8 统计学处理  22-23
  1.2 结果  23-33
    1.2.1 单参数流式检测肺癌细胞株中CD133.CD24.CD44.CD221的表达水平示意图  23-24
    1.2.2 单参数流式检测肺腺癌细胞株A549中CD133、CD24、CD44和CD #221的表达水平  24-25
    1.2.3 单参数流式检测肺鳞癌细胞株YTMLC-9中CD133、CD24、CD44、CD221的表达水平  25-27
    1.2.4 单参数流式检测肺大细胞肺癌细胞株L9981 中 CD133、CD24、CD #44和CD221的表达水平  27-28
    1.2.5 单参数流式检测大细胞肺癌细胞株NL9980中CD133、CD24、CD #44和CD221的表达水平  28-29
    1.2.6 双参数标记法检测L9981中的CD133、CD24和CD221的表达  29-30
    1.2.7 双参数标记法检测L9980中的CD133、CD24和CD221的表达  30-33
  1.3. 讨论  33-38
  1.4. 小结  38-39
二、无血清悬浮培养并顺铂诱导处理A549和L9981细胞富集肺癌球体细胞及其生物学功能研究  39-60
  2.1 对象与方法  39-47
    2.1.1 细胞株  39
    2.1.2 主要试剂和设备  39-40
    2.1.3 主要实验设备  40-41
    2.1.4 主要试剂溶液的配制  41-42
    2.1.5 细胞培养  42-43
    2.1.6 顺铂诱导处理细胞  43
    2.1.7 检测无血清悬浮培养并顺铂处理后的A549和L9981细胞和各自血清贴壁培养细胞的增值能力和倍增时间并绘制生长曲线  43-44
    2.1.8 Transwell侵袭试验  44-45
    2.1.9 致瘤性分析  45-46
    2.1.10 统计分析  46-47
  2.2. 结果  47-56
    2.2.1 无血清悬浮培养并顺铂诱导处理细胞和含血清贴壁培养细胞的形态比较  47-49
    2.2.2 无血清顺铂处理前后细胞生长曲线比较  49-52
    2.2.3 Transwell侵袭实验结果  52-53
    2.2.4 裸鼠成瘤性实验结果  53-56
  2.3 讨论  56-59
  2.4 小结  59-60
三、CD133和CD24在肺癌干细胞样细胞中的表达水平和裸鼠移植瘤的研究  60-70
  3.1 对象和方法  60-62
    3.1.1 细胞株和实验组织  60
    3.1.2 主要试剂和材料  60
    3.1.3 主要仪器设备  60
    3.1.4 主要试剂溶液的配制  60
    3.1.5 无血清悬浮的肺癌干细胞样细胞上机检测CD133、CD24的表达水平  60
    3.1.6 裸鼠体内所致肿瘤的HE染色和免疫组织化学研究  60
    3.1.7 移植瘤组织中CD133和CD24免疫组化分析  60-62
  3.2 结果  62-66
    3.2.1 顺铂诱导处理肿瘤细胞L9981、A549在逐代培养中CD133、CD24表达水平  62-64
    3.2.2 移植瘤组织病理切片情况  64-65
    3.2.3 移植瘤组织CD133和CD24免疫组化结果  65-66
  3.3 讨论  66-69
  3.4 小结  69-70
结论  70-72
参考文献  72-80
发表论文和参加科研情况说明  80-81
  在学期间发表论文的情况  80
  在学期间参加科研的情况  80-81
综述  81-97
  综述参考文献  90-97
致谢  97

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