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Jagged 1介导的Notch信号通路激活诱导大鼠肝移植术后胆管上皮—间质转变的研究

作　者: 刘小卫
导　师: 郑启昌
学　校: 华中科技大学
专　业: 外科学
关键词: 大鼠肝移植胆管损伤 Jagged 1/Notch信号通路激活上皮-间质转变
分类号: R657.3
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：探讨Jagged 1/Notch信号通路诱导的上皮-间质转变在大鼠肝移植术后损伤胆管上皮细胞中的作用研究。方法：1)96只清洁级、雄性健康SD大鼠随机分成3组,A组；肝移植组(48只),B组；假手术组(24只,开腹肝脏游离,不损伤血管和胆管)和C组；正常对照组(24只)。采用改良Kamada原位“二袖套”法建立大鼠肝移植模型,大鼠随机分成受体组和供体组,受体体重略大于供体体重,供、受体肝动脉结扎,不吻合。分别于术后1d、7d、14d和28d采集静脉血检测总胆红素(TBIL)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、谷丙转氨酶(ALT),同一时间点处死大鼠取肝组织,苏木素-伊红染色(HE)观察三组大鼠肝脏病理学改变,免疫组织化学定位和免疫印迹(western-blot)法检测肝组织Notch信号配体Jagged1、靶基因Hes1,间质细胞标记成纤维细胞特异性蛋白-1(FSP-1)、波形蛋白(vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和胆管细胞特异性标记角蛋白19片段(CK19)的表达。2)体外分离培养SD大鼠原代肝内胆管上皮细胞(rIBECs),锥虫蓝拒染检测活性、免疫细胞化学(CK19)鉴定细胞。构建pEGFP-IRES2-Jagged 1真核表达载体并Lipofectamine TM2000转染原代肝内胆管上皮细胞,设转染组、转染+Notch信号抑制剂DAPT处理组(剂量为：1μmol/L)、空载体组、未处理组。western-blot法检测四组细胞Jagged 1蛋白、Hes1蛋白,间质细胞标记蛋白(FSP-1,vimentin,α-SMA)和CK19蛋白的表达。倒置显微镜观察四组胆管细胞的形态,transwell小室法检测四组细胞的迁移侵袭能力。结果：1)成功建立大鼠原位肝移植模型,受体大鼠术后正常条件下喂养存活良好。术后肝功能检测,肝移植组大鼠淤胆明显,TBIL(32.05±3.28μmol/L),γ-GT(118.3±17.4μmol/L)升高显著(P<0.05),尤以术后14d升高明显,术后28d出现下降。苏木素-伊红染色(HE)显示肝移植组术后门脉汇管区损伤胆管呈明显的小胆管反应改变；胆管扩张、胆管细胞增生、胆管细胞数量增多、纤维组织增生、门脉汇管区炎性细胞浸润。免疫组化检测：肝移植组术后增生胆管细胞的胞膜及胞浆阳性表达Jagged 1,Hes1,呈棕黄颗粒,且随术后时间延长,棕黄色颗粒颜色加深,对照组Jagged 1,Hes1弱表达于正常胆管,同时弱表达门脉汇管区、肝细胞胞膜以及肝静脉内皮细胞。肝移植组间质细胞标记FSP-1,vimentin,α-SMA均阳性表达于增生显著的胆管细胞,呈棕黄色颗粒,且随术后时间延长,棕黄色颗粒颜色加深,同时增生胆管细胞阴性表达CK19。Western-blot检测：对照组肝组织Jagged 1蛋白、Hes1蛋白低表达,间质细胞标记蛋白(FSP-1,vimentin,α-SMA)低表达,CK19蛋白高表达。术后7d肝移植组Jagged 1,Hes1,FSP-1,vimentin,α-SMA均出现高表达,且随术后时间延长,表达逐渐增强,CK19蛋白表达明显减弱。21转染Jagged 1载体大鼠肝内胆管上皮细胞Jagged 1蛋白、Hes1蛋白高表达,伴随间质标记蛋白(FSP-1,vimentin,α-SMA)高表达, CK19蛋白低表达,DAPT处理组、空载组和未处理组Jagged 1蛋白、Hes1蛋白低表达,且间质细胞标记蛋白(FSP-1,vimentin,α-SMA)低表达,而CK19蛋白高表达。转染组细胞的形态呈梭形样改变,其余三组细胞为鹅卵石样细胞形态。transwell小室检测细胞迁移侵袭能力发现,转染组迁移细胞(21333±520)与其余三组迁移细胞(2083±381,2000±661,1833±389)差异具有显著统计学意义(P<0.05)。结论：改良Kamada原位“二袖套”大鼠肝移植术后早期(<4w),损伤胆管呈小胆管反应改变,该过程中Jagged 1激活的Notch信号通路,与肝内胆管上皮细胞可能发生的上皮-间质转变密切相关。

全文目录

英文缩略词表  6-7
摘要  7-9
Abstract  9-12
绪论  12-17
  一、选题背景及研究意义  12-14
  二、研究目标及研究内容  14-15
  参考文献  15-17
第一部分大鼠肝移植模型的建立及术后胆管损伤改变  17-34
  前言  17
  材料与方法  17-21
  结果  21-30
  讨论  30-31
  参考文献  31-33
  小结  33-34
第二部分大鼠肝移植术后损伤胆管中Ntoch信号通路激活与上皮一间质转变的关系  34-56
  前言  34-35
  材料与方法  35-44
  结果  44-52
  讨论  52-54
  参考文献  54-56
第三部分转染Jaggedl基因的肝内胆管上皮细胞与上皮一间质转变的关系  56-78
  前言  56-57
  材料与方法  57-65
  结果  65-74
  讨论  74-76
  参考文献  76-78
总结  78-79
综述  79-94
  参考文献  87-94
攻读博士期间发表的学术论文  94-95
致谢  95

Jagged 1介导的Notch信号通路激活诱导大鼠肝移植术后胆管上皮—间质转变的研究

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