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基于纳米微粒模拟酶的光分析方法构建及其应用研究

作　者: 石文兵
导　师: 黄玉明
学　校: 西南大学
专　业: 分析化学
关键词: 纳米微粒 模拟酶 化学发光分析法 比色分析法
分类号: O629.8
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


因其催化效率高和反应特异强,天然酶已在不同领域得到了广泛关注,然而天然酶是一种生物催化剂,它们易受外界环境的影响而失活。近年来,模拟酶的研究备受人们关注。目前人们已利用卟啉、主体试剂、印迹高分子聚合物、膜体系及配合物等作为模拟酶。纳米材料具有表面效应、量子尺寸效应、体积效应以及宏观量子隧道效应等特性,它们已在化学、物理、生物医药、生命科学及环境保护等领域受到人们的青睐。然而,人们一般认为,无机纳米粒子是化学和生物惰性物质,其催化活性一直被忽视。自2007年阎锡蕴研究小组发现四氧化三铁纳米粒子具有过氧化物模拟酶特性以来,各种纳米材料,如氧化物纳米微粒、碳基纳米材料、单金属纳米微粒和双金属复合纳米材料已被发现具有模拟酶特性。已有研究表明,纳米微粒是一种敏感型材料,人们可以选择不同的合成方法来获得不同组成和不同形貌的纳米微粒以满足特定的催化目的。为此,本文基于基于铁氧体磁性纳米微粒、碳点和CeO2 NPs的过氧化物模拟酶特性构建了H202光分析法。论文共分为七章：第一章：综述了模拟酶的研究进展。第二章：以H202-鲁米诺化学发光反应为模型体系,研究了CuFe2O4、MnFe2O4、NiFe2O4前驱体和MgFe2O4前驱体等6种铁氧体磁性纳米微粒的过氧化物模拟酶特性,并与辣根过氧化物酶(HRP)进行比较。结果表明：(i)与HRP类似,6种铁氧体磁性纳米微粒均能够催化H202氧化鲁米诺产生增强化学发光,其催化活性依赖于pH值、温度以及底物(H202)浓度,表明本研究所使用的铁氧体磁性纳米微粒具有过氧化物模拟酶特性；(ii)以H202为底物的表观米氏常数(Km)从小到大依次为CoFe2O4< y-Fe2O3< NiFe2O4前驱体< CuFe2O4< MnFe2O4< MgFe2O4前驱体,均大于HRP的Km值；(iii)基于铁氧体磁性纳米微粒的过氧化物模拟酶比HRP具有更佳的pH及温度耐受能力。第三章：本章以CoFe2O4纳米微粒催化H202-鲁米诺化学发光体系为例构建了测定H202的新方法。在最佳实验条件下,方法的线性范围为0.1—10μM,检测限为10 nM。该法已成功用于水样中H202和血清中葡萄糖的测定。这种基于CoFe2O4纳米微粒的过氧化物模拟酶在环境分析、生物分析和化学发光分析等领域将具有巨大的应用潜力。第四章：基于CoFe2O4纳米微粒的过氧化物模拟酶固载于溶胶凝胶基质中构建了一种新型化学发光流通式H202生物传感器。将溶胶凝胶固载的CoFe2O4纳米微粒填充于玻璃管(i.d.40 mm x 3 mm)作为化学发光流通池(感应元件)。CoFe2O4纳米微粒催化H202氧化鲁米诺化学发光反应。当鲁米诺和H202经过化学发光流通池时,H202被识别,CoFe2O4纳米微粒催化H202-鲁米诺体系产生强烈的化学发光。利用流动注射系统仔细研究了该H202生物传感器的主要参数,如发光动力学参数、检测限、响应线性范围、重现性、运行和储存稳定性。在最佳实验条件下,化学发光响应与H202浓度在0.01—10μM范围内呈良好的线性关系,检测限(3σ)为3.2 nM。该传感器具有出很高的重现性、稳定性和抗恶劣环境能力等优点。该传感器已经被成功应用于测定雨水中的H202。当把葡萄糖氧化酶固定于进样环与H202传感器联用,结合停留技术,可实现对血样中葡萄糖的测定。第五章：利用组织酶(菠菜叶中的草酸氧化酶)和基于CoFe2O4纳米微粒的过氧化物模拟酶构建了一种草酸化学发光流通式生物传感器。菠菜叶和CoFe2O4纳米微粒分别作为分子识别单元和过氧化物模拟酶,在组织识别柱中草酸氧化酶催化溶解氧氧化草酸生成的H202进而与鲁米诺反应,在CoFe2O4纳米微粒(过氧化物模拟酶)的催化下产生强烈化学发光。详细考察了化学发条件、组织柱识别条件以及传感器的稳定性和寿命。实验结果表明,在过氧化物模拟酶的催化下,该生物传感器的灵敏度得到大大提高。在最佳实验条件下,化学发光强度与草酸的浓度在1.0×10-8—1.0×10-4 M内呈正比,检出限(3σ)为3.2 nM。对1.0μM草酸进行11次平行测定,其RSD为2.9%。该传感器已经成功应用于尿样中草酸含量的测定。第六章：制备了一种稳定性高和分散性好的碳点,并研究了其过氧化物模拟酶特性。碳点对H202氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)表现出良好的催化活性。与天然辣根过氧化物酶(HRP)相似,其催化特性受温度、pH和H202浓度的影响。实验结果表明,在温度为35°C、pH为3.5和H202为300 mM时可获得最大的催化效果。Michaelis-Menten动力学研究表明,碳点对TMB的Km为0.039 mM小于HRP对TMB的KTm(0.155mM),这说明碳点对TMB的亲和力大于HRP对TMB的亲和力。基于碳点催化活性对H202浓度具有依赖性,构建了一种简单、灵敏和选择性高的比色方法测定血样中葡萄糖含量。同时,研究了碳点的可能催化机理。第七章：合成了一种稳定和水溶性好的聚丙烯酸修饰CeO2 NPs,动态光散射数据表明该纳米微粒水合粒径为5 nm左右；傅里叶变换红外光谱结果表明,聚丙烯酸成功修饰于CeO2 NPs表面；XPS光谱表明所合成的纳米微粒含有Ce3+和Ce4+两种价态存在。该纳米微粒能够催化H202氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)发生显色反应,表现出过氧化物模拟酶催化活性。其催化机理为TMB和H202首先吸附于CeO2 NPs表面,TMB把其氨基上的孤对电子传递给CeO2NPs,进而CeO2 NPs把电子传递给其表面的H2O2, H2O2捕获电子后产生OH和O27HO2,这些自由基氧化TMB变色。基于CeO2 NPs催化TMB变色反应对H202浓度有依赖性和葡萄糖氧化酶能够催化溶解氧氧化葡萄糖产生H202的原理,构建了一种简单、灵敏、选择性高的测定血清中葡萄糖含量检测方法。

全文目录


摘要  7-10
Abstract  10-14
第一章 文献综述  14-32
  1.1 基于分子印迹聚合物的模拟酶  14-19
  1.2 基于主体试剂的模拟酶  19-24
  1.3 基于卟啉的模拟酶  24-25
  1.4 基于膜体系及配合物的模拟酶  25-26
  1.5 基于纳米微粒的模拟酶  26-32
第二章 铁氧体磁性纳米微粒的过氧化物模拟酶特性  32-42
  2.1 引言  32-33
  2.2 实验部分  33-35
    2.2.1 试剂与仪器  33
    2.2.2 纳米微粒的制备及表征  33-34
    2.2.3 实验方法  34-35
    2.2.4 纳米微粒催化H_2O_2-鲁米诺发光特性实验  35
    2.2.5 表观酶促动力学曲线测定  35
    2.2.6 最适pH、温度和稳定性实验  35
  2.3 结果与讨论  35-40
    2.3.1 化学发光条件优化  35-36
    2.3.2 纳米微粒过氧化物模拟酶特性  36-39
    2.3.3 磁性纳米微粒与HRP稳定性比较  39-40
  2.4 本章小结  40-42
第三章 CoFe_2O_4纳米微粒模拟过氧化物模拟酶及其应用研究  42-50
  3.1 引言  42-43
  3.2 实验部分  43-45
    3.2.1 试剂和材料  43
    3.2.2 仪器装置  43
    3.2.3 CoFe_2O_4纳米微粒的制备  43-44
    3.2.4 CoFe_2O_4纳米微粒的表征  44
    3.2.5 化学发光分析实验步骤  44-45
    3.2.6 催化特性实验  45
    3.2.7 水样中H_2O_2的测定  45
    3.2.8 血样中葡萄糖的测定  45
  3.3 实验结果与讨论  45-49
    3.3.1 实验条件优化  45-46
    3.3.2 方法的响应特性  46-47
    3.3.3 干扰实验  47
    3.3.4 样品分析  47-49
  3.4 本章小结  49-50
第四章 溶胶凝胶固载CoFe_2O_4纳米微粒及H_2O_2化学发光传感器的构建  50-62
  4.1 引言  50-51
  4.2 实验部分  51-53
    4.2.1 试剂和材料  51
    4.2.2 仪器  51-52
    4.2.3 生物传感器的构建  52-53
    4.2.4 化学发光分析步骤  53
  4.3 结果与讨论  53-60
    4.3.1 CoFe_2O_4纳米微粒的表征  53
    4.3.2 热重分析  53
    4.3.3 生物传感器的化学发光响应  53-55
    4.3.4 实验条件优化  55-56
    4.3.5 测定葡萄糖实验条件优化  56
    4.3.6 生物传感器对H_2O_2和葡萄糖的响应特性  56-58
    4.3.7 生物传感器的重现性和稳定性  58-59
    4.3.8 干扰实验  59
    4.3.9 应用  59-60
  4.4 本章小结  60-62
第五章 基于组织酶和过氧化物模拟酶联用构建一种新型草酸生物传感器  62-72
  5.1 引言  62-63
  5.2 实验部分  63-65
    5.2.1 药品与试剂  63
    5.2.2 仪器设备  63-64
    5.2.3 制备植物组织识别元件  64
    5.2.4 标准曲线  64
    5.2.5 制备样品  64-65
  5.3 结果与讨论  65-71
    5.3.1 传感器识别机制  65
    5.3.2 优化生物传感器识别条件  65-67
    5.3.3 发光条件优化  67-68
    5.3.4 稳定性  68
    5.3.5 精密度和重现性  68-69
    5.3.6 响应特性  69
    5.3.7 干扰实验  69-70
    5.3.8 应用  70-71
  5.4 本章小结  71-72
第六章 碳点作为过氧化物模拟酶及其在葡萄糖测定中的应用  72-84
  6.1 引言  72
  6.2 实验部分  72-74
    6.2.1 药品与试剂  72-73
    6.2.2 碳点的制备  73
    6.2.3 分析测试步骤  73-74
  6.3 结果与讨论  74-82
    6.3.1 碳点的表征  74-75
    6.3.2 碳点的过氧化物模拟酶特性  75-77
    6.3.3 碳点与辣根过氧化物酶的稳定性比较  77-78
    6.3.4 动力学参数  78-80
    6.3.5 催化机理  80
    6.3.6 应用  80-82
  6.4 本章小结  82-84
第七章 二氧化铈纳米微粒的内源性过氧化物酶活性及其在葡萄糖检测中的应用  84-96
  7.1 引言  84
  7.2 实验部分  84-86
    7.2.1 实验材料  84-85
    7.2.2 仪器设备  85
    7.2.3 实验方法  85-86
  7.3 结果与讨论  86-94
    7.3.1 CeO_2 NPs的表征  86-87
    7.3.2 CeO_2 NPs的过氧化物模拟酶特性  87-90
    7.3.3 动力学参数  90-91
    7.3.4 可能反应机理  91-92
    7.3.5 应用  92-94
  7.4 本章小结  94-96
结论  96-98
参考文献  98-116
攻读博士学位期间发表的论文  116-118
致谢  118

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中图分类: > 数理科学和化学 > 化学 > 有机化学 > 天然化合物 > 酶、激素
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