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釉基质蛋白在体外对诱导性多能干细胞的作用及其共同在牙周再生中的应用

作　者: 段学静
导　师: 杨丕山
学　校: 山东大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: iPS细胞 EMD 牙周再生
分类号: R781.4
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

背景和目的：牙周病治疗的最终目标是重建因炎症过程而破坏的牙周组织,恢复其结构和功能,即实现牙周组织的再生。但因牙周病丧失的牙周组织,其修复与重建的难度很大。多年来,人们一直在寻求能有效增加牙周新附着、促进牙周组织再生的治疗方法,并已开展了牙周骨移植、引导牙周组织再生(GTR)技术等多方面的研究,取得了一定的进展,但在恢复牙周组织的生理结构和功能上还远未达到所期望的目标。组织工程应用于牙周组织缺损修复为牙周病的治疗开辟了一条新途径。组织工程学的主要研究重点在于以下三个方面：(1)种子细胞的来源；(2)生物载体支架材料的选择；(3)有效的细胞因子。要进行系统的牙周组织工程研究,就必须首先对以上三个问题进行探讨、研究和解决。其中,选择合适的种子细胞和有效的细胞因子是非常重要的。诱导性多功能干细胞(induced Pluripotent Stem cells, iPS细胞)来源于成体细胞,其获得方法相对简单稳定.不需要使用生殖细胞或破坏早期胚胎.在技术上和伦理上都更有优势。iPS细胞具有与胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESC)相似的生物学特性并能在适当的诱导条件下分化为3个胚层的细胞,是具有全能分化能力的干细胞。此外,iPS细胞可由患者自身细胞诱导获得,具有与患者自身相同的基因组成,不会引起机体的免疫排斥反应。这种种特性表明iPS细胞成为理想种子细胞的可能性。以前很多研究显示了釉基质蛋白(enamel matrix derivates, EMD)在牙周再生中的作用。EMD能够诱导无细胞外源性纤维牙骨质的再生(acellular extrinsic fiber cementum, AEFC)°。无细胞性牙骨质与牙本质的结合较细胞性牙骨质与牙本质的结合更加牢固。Boyan等在实验中发现EMD可能具有骨促进而不是骨诱导作用,但使用剂量应达到或超过一定的阈值。在牙周组织再生的过程中,EMD可能作为一种基质,形成与牙周组织发育时类似的微环境,通过促进成骨细胞的功能活动而有利于牙槽骨的再生。本研究中,体外实验研究iPS细胞的成骨分化和EMD对iPS细胞的诱导作用；体内实验,将iPS细胞和EMD共同用于牙周组织骨缺损的组织工程学修复,探讨将其应用于牙周再生的可行性。方法和材料：(1)使用基质胶(Matrigel)包被培养皿,采用无滋养层的方法培养人的iPS细胞。RT-PCR检测培养人iPS细胞中干细胞特异性基因Oct4和Nanog的表达。然后采用克隆悬浮的方法获取拟胚体(embryoid body, EB)。(2)收集悬浮培养形成的EB,移入0.1%明胶处理过的培养板中,贴壁,并分别在普通培养液、加了矿化诱导液的培养液和加了EMD的培养液中培养,观察不同的培养液对细胞的向成骨方向分化和体外矿化的影响。采用PCR和Real-time PCR检测成骨相关因子和蛋白,包括Runx2, OC, BSP等的mRNA表达；分别检测不同培养液中的细胞在培养后的第7,12,23,30天的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的活性,观察不同培养液中细胞在不同时间点的ALP蛋白活性；将细胞在不同培养液中培养28天后,茜素红染色观察其在体外形成矿化结节的能力,并分析其矿化面积所占的百分比。(3)取12.5天左右的孕鼠,原代培养小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF),使用适量γ射线照射后用于制备滋养层。在MEF滋养层上培养小鼠的iPS细胞,使用悬滴法获得EB.(4)在裸小鼠的下颌磨牙区制作牙周骨缺损,然后使用组织工程技术修复牙周缺损。实验分为三组：单纯材料组,材料+EMD组和材料+EMD+鼠iPS细胞组,术中所用的材料为羟基磷灰石／/丝复合支架材料。术后12和24天,Real-time PCR检测三组标本其新生骨组织的成骨相关因子和蛋白Runx2, OC, BSP,Osx的mRNA表达；对标本进行Micro-ct检测,立体观察分析牙周缺损区硬组织的新生情况；组织学分析来观察缺损处成骨,成牙骨质以及牙周修复的状况。结果：(1)在显微镜下观察,未分化的人iPS细胞呈集落样生长,不典型的圆形或椭圆形,集落边缘光滑清晰,有的集落边缘可见有少量细胞分化。细胞呈团状排列,胞核大,胞浆少,核浆比较高。克隆边缘分化后的细胞呈梭形或多边型,细胞核小,胞浆丰富。RT-PCR实验结果显示培养的人iPS细胞中有Oct4和Nanog的表达。镜下可观察到,形成的EB悬浮在培养液中,呈现为规则或不太规则的球形。中心较致密,边缘透亮。(2) RT-PCR结果显示,细胞BSP的mRNA表达水平,EMD和普通培养液中相差不大,均低于矿化诱导液组,统计学上有极显著性差异(P<0.01)。第20天时,Runx2的mRNA表达水平,EMD组高于矿化诱导液组和普通培养液组,矿化诱导液组又高于普通培养液组,且有极显著性差异(P<0.01)。在培养的第30天,同样的,EMD组仍然有最高水平的表达,且差距有统计学意义(P<0.05)。在第20和30天时,OC的mRNA表达水平,EMD组均为最低,且与其他两组相比,均有极显著性差异(P<0.01); ColI的mRNA表达水平,在矿化诱导液组中最高,且其差异有统计学意义,而其余两组差别不大。茜素红染矿化结节的结果也发现,三组中,EMD实验组生成的矿化结节也最少(P<0.01)。ALP活性检测发现,在第23天左右,不同培养液中的细胞其ALP活性达到最大值,且EMD培养液中的细胞ALP活性低于另外两组。(3)体内动物实验结果发现,在术后12天和24天,相较其它两组而言,材料+EMD+鼠iPS细胞的动物组均有较高的OC, Osx和Runx2的mRNA基因表达(P<0.01或者<0.05)。组织学分析显示,术后12天和24天,新生成骨的百分比,在材料+EMD对照组中与在单纯材料组中的相似。在丝材料+EMD+iPS细胞实验组中比在其他两个组中都要高,且有显著的统计学差异(p<0.01)。Micro-CT结果分析显示在相同层次上,EMD+iPS细胞移植组的标本比EMD组的新形成的硬组织中多。使用3-D软件将组织缺损处从CT立体图像中切出来,也可以明显看出实验组的硬组织密度要比对照组高的多,这些都提示了iPS细胞实验组中更多硬组织的生成。HE染色也显示,术后24天,移植了iPS细胞的动物组有更多的新生骨组织和新生牙骨质。结论：体外细胞诱导实验中,EMD能很强的促进RUNX2的mRNA表达,但是却抑制了OC的表达和体外矿化。实验结果表明EMD可能促进间充质前体干细胞向成骨细胞方向分化,但却抑制了其终末分化为成熟的成骨细胞和体外矿化。体内动物实验中,移植了iPS细胞和EMD可促进动物新生牙骨质和牙槽骨的生成,有利于牙周缺损的修复,提示iPS细胞作为牙周组织工程种子细胞的可能性。

全文目录

摘要  8-12
ABSTRACT  12-17
符号说明  17-18
第一部分矿化诱导液和EMD对人诱导性多能干细胞的作用  18-44
  前言  18-20
  第一节人iPS细胞的无饲养层培养  20-28
    实验材料与方法  20-26
      一实验材料  20-21
      二实验方法  21-26
    实验结果  26-28
  第二节人iPS细胞的成骨分化  28-40
    实验材料与方法  28-34
      一实验材料  28-29
      二实验方法  29-34
    实验结果  34-40
  讨论  40-44
第二部分小鼠iPS细胞培养及其和EMD共同应用于牙周再生修复  44-72
  前言  44-46
  第一节 MEF细胞的原代培养和小鼠iPS细胞培养  46-56
    实验材料与方法  46-53
      一实验材料  46-48
      二实验方法  48-53
    实验结果  53-56
  第二节小鼠iPS细胞和EMD共同修复裸小鼠的牙周骨缺损  56-69
    实验方法  56-61
    实验结果  61-69
  讨论  69-72
结论  72-73
文献综述  73-78
参考文献  78-86
致谢  86-87
研究生期间发表文章  87-88
附录  88-117

釉基质蛋白在体外对诱导性多能干细胞的作用及其共同在牙周再生中的应用

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