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益髓通经方对实验性自身免疫性神经炎大鼠调节性T细胞的影响

作　者: 张二力
导　师: 赵建军
学　校: 长春中医药大学
专　业: 中医内科学
关键词: 益髓通经方实验性自身免疫性神经炎调节性T细胞脑髓理论
分类号: R285
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:通过观察益髓通经方对格林-巴利综合征(GBS)的经典动物模型—实验性自身免疫性神经炎(EAN)大鼠周围神经病理形态学超微结构、神经电生理功能、脾淋巴细胞增殖功能及对血清IL-10、TGF-β水平和胸腺、脾、淋巴结CD4+CD25+T细胞mRNA表达水平的影响,探讨GBS的细胞免疫机制以及益髓通经方对本病的治疗机理,验证益髓通经方对GBS的临床疗效,进一步丰富中医“脑髓”理论,完善中医治疗痿病的理论和实践。方法:采用P0180-199多肽及IFA免疫Lewis大鼠制备EAN动物模型。将造模成功的大鼠100只随机分为模型组、免疫球蛋白治疗组,益髓通经方高、中、低剂量组5组,每组20只,另取20只正常鼠作为空白对照组,共分为6组。免疫球蛋白治疗组于免疫后第11天起给予人免疫球蛋白注射液480mg/只·天腹腔注射治疗,共5天。益髓通经方高、中、低各组于免疫后第11天分别给予益髓通经方溶液2.0ml/d、1.5ml /d、1.0ml/d灌胃治疗直至处死;在免疫后第10天,空白组及模型组各取5只大鼠处死、在免疫后第18、25、39天各组分别随机抽取5只大鼠处死检测各组大鼠坐骨神经运动传导速度;应用光镜、电镜观察坐骨神经病理形态学及超微结构的变化;采用CCK-8试剂检测大鼠脾脏淋巴细胞增殖能力;ELISA法检测血清IL-10、TGF-β表达水平;采用流式细胞技术检测各组大鼠胸腺、脾、腹股沟淋巴结CD4+CD25+T/ CD4+T比率,并以RT-PCR法检测上述淋巴器官调节性T细胞Foxp3 mRNA表达水平。结果:1.通过电镜观察各组大鼠坐骨神经病理变化:模型组在免疫后第18天出现有髓神经纤维结构病变,髓鞘折叠起皱、轴索与髓鞘板层分离等改变,在第25天时出现较明显髓鞘脱失或髓鞘溶解,在39天时仍有广泛脱髓鞘及轴索崩解改变。经治疗,益髓通经方治疗组与免疫球蛋白组的髓鞘脱失情况得到明显改善,有髓纤维髓鞘板层结构整齐,同时还可见到胶原纤维聚集及有髓神经纤维新生等改变。2.应用BL-420生物机能实验系统检测EAN大鼠坐骨神经运动传导速度。模型组在免疫后第10天起运动神经传导速度下降,在第18天、25天进一步下降,在第39天时神经传导速度略有改善。益髓通经方各治疗组及球蛋白治疗组在上述时间点均优于模型组,在第39天治疗4周时,益髓通经方高剂量组神经传导速度同球蛋白治疗组比较无显著性差异(P>0.05),优于中、低剂量组(P<0.01),但均不及空白组(P<0.01)。3.淋巴细胞增殖实验显示,模型组及益髓通经方各治疗组对P0多肽及ConA的刺激增殖反应在第10天、18天、25天进行性增强,在第25天达到顶峰,随后下降,但模型组的增殖强度均高于同期中药治疗组。球蛋白治疗组淋巴细胞增殖强度在第18天起下降。在第39天时益髓通经方各治疗组同球蛋白组淋巴细胞增殖反应基本恢复正常,均优于模型组。4.在免疫后第10天,模型组血清IL-10水平增高,在第18天显著增高,在25天起下降,与EAN大鼠疾病严重程度呈正相关;模型组血清TGF-β水平在免疫后第10天、第18天低于空白组,在免疫后第25天与空白组持平,在39天高于空白组,与EAN大鼠病情改善情况呈正相关。益髓通经方高剂量组及球蛋白治疗组IL-10水平在以上各时间点均低于模型组,而其TGF-β水平则高于模型组。5.模型组在免疫后第10天,胸腺、脾、腹股沟淋巴结CD4+CD25+/ CD4+比率降低,相应的,其Foxp3 mRNA表达水平也降低。在免疫后第18天,即临床症状高峰期,这种趋势更加明显,模型鼠CD4+CD25+T比率及Foxp3 mRNA表达水平均处于谷底。在免疫后第25天,模型鼠进入恢复期,此时Treg细胞数量及Foxp3 mRNA表达水平也随之回升。经过药物治疗,益髓通经方高剂量组与免疫球蛋白治疗组在免疫后第18天均表现出对CD4+CD25+T细胞的改善作用,在胸腺、淋巴结Foxp3的表达方面,高剂量组甚至优于球蛋白组,在第39天时,高剂量组与球蛋白组作用持平,均优于中低剂量组。结论:1.益髓通经方可以使EAN模型鼠病变坐骨神经有髓神经纤维结构改善,髓鞘脱失减少,髓鞘板层排列整齐、清晰度增强,有助于受损神经修复和再生。2.益髓通经方组能提高EAN大鼠坐骨神经运动传导速度。3.益髓通经方能抑制EAN模型鼠脾淋巴细胞对特异性或非特异性抗原刺激的异常增殖反应,有助于减轻CD4+T淋巴细胞介导的免疫损伤。4.益髓通经方能降低EAN模型鼠血清IL-10的表达水平,提高保护性因子TGF-β的表达水平,有助于恢复模型鼠细胞因子平衡状态。5.益髓通经方有助于EAN大鼠胸腺、脾、腹股沟淋巴结调节性T细胞数量及功能恢复正常,随着调节性T细胞功能恢复,对CD4+T细胞的抑制作用增强,对于恢复免疫平衡状态,终止周围神经的炎性损伤起到积极作用。

全文目录

中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-12
英文缩略语表  12-13
前言  13-14
文献综述  14-28
  一调节性性T细胞概述  14-19
  二调节性T细胞与自身免疫性疾病  19-28
实验研究  28-60
  实验一益髓通经方对EAN 大鼠周围神经病理形态学超微结构的影响  29-36
    1 实验材料  29
    2 实验方法  29-31
    3 统计学处理  31
    4 结果  31-36
  实验二益髓通经方对EAN 大鼠神经电生理功能的影响  36-39
    1 实验材料  36
    2 实验方法  36
    3 统计学处理  36
    4 结果  36-39
  实验三益髓通经方对EAN 大鼠淋巴细胞增殖功能的影响  39-43
    1 实验材料  39
    2 实验方法  39-40
    3 统计学处理  40
    4 结果  40-43
  实验四益髓通经方对EAN 大鼠血清IL-10、TGF-β水平的影响  43-47
    1 实验材料  43
    2 实验方法  43
    3 统计学处理  43
    4 结果  43-47
  实验五益髓通经方对EAN 大鼠调节性T 细胞水平影响  47-60
    一流式细胞仪检测胸腺、脾、腹股沟淋巴结CD4+CD25+T/ CD4+T 比率  47-52
      1 实验材料  47
      2 实验方法  47
      3 统计学处理  47-48
      4 结果  48-52
    二 RT-PCR 检测大鼠胸腺、脾脏及腹股沟淋巴结Foxp3 mRNA 表达水平  52-60
      1 实验材料  52-53
      2 实验方法  53-55
      3 统计学处理  55
      4 结果  55-60
讨论  60-82
结语  82-83
致谢  83-84
参考文献  84-94
附图  94-98

益髓通经方对实验性自身免疫性神经炎大鼠调节性T细胞的影响

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